心臟干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為竇房結(jié)樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:穩(wěn)定獲得大量c-kit表型小鼠心臟干細(xì)胞(cardiacstemcells,CSCs),觀察其生物學(xué)特性,誘導(dǎo)其向心肌樣細(xì)胞分化,并探討其是否有分化為竇房結(jié)樣細(xì)胞的潛能。
　　方法:1、原代CSCs的分離、培養(yǎng)及傳代:取2～3周體重10～15g昆明小鼠,雌雄不拘。麻醉后頸椎脫臼處死、消毒無(wú)菌條件下開胸暴露心臟,在解剖顯微鏡下分別取下心房和部分心室肌組織,分為心房組和心室組。通過心肌組織塊貼壁培養(yǎng)法分別培養(yǎng)兩組組織塊,獲取原代

2、小鼠CSCs,觀察心臟不同部位組織塊中的CSCs“爬”出時(shí)間和增殖能力差異。待CSCs長(zhǎng)滿約70％～80%培養(yǎng)皿底時(shí),用0.2%胰酶輕柔差速消化,收集消化液后加入CEM培養(yǎng)基中和胰酶,離心后棄上清,加入CEM重懸后傳代備用。2、組織塊共培養(yǎng)法誘導(dǎo)CSCs的體外分化:收集消化備用的CSCs分兩部份,一部份傳代貼壁1天后行免疫熒光檢測(cè)CSCs特異性標(biāo)志物c-kit,以及心肌細(xì)胞標(biāo)志物:ɑ輔肌動(dòng)蛋白(α-Actinin)、心肌特異性肌鈣蛋白I

3、(cardiacTroponin-I,cTnI)、心肌特異性肌鈣蛋白T(cardiacTroponin-T,cTnT)的表達(dá)情況。另一部份分為A、B兩組:A組采用Transwell小室與心肌組織塊共培養(yǎng)、B組為無(wú)組織塊共培養(yǎng)的對(duì)照組。共培養(yǎng)10天后,分別用免疫熒光染色檢測(cè)A、B兩組細(xì)胞的CSCs特異性標(biāo)志物c-kit,以及α-Actinin、cTnI、cTnT,并且通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞是否可記錄到If電流。
　　結(jié)果:

4、1、心肌組織塊貼壁2天后可見成纖維細(xì)胞長(zhǎng)出,心房組:4.92±0.88天開始“爬”出CSCs;而心室組:CSCs“爬”出時(shí)間為6.27±1.08天,經(jīng)秩和檢驗(yàn)P<0.05。兩組細(xì)胞形態(tài)均呈圓形、胞質(zhì)折光度好,分散附著于成纖維細(xì)胞上。心房組CSCs約15.23±1.58天融合至70～80%可傳代,而心室組17.35±1.68天后融合至70～80%可傳代,經(jīng)秩和檢驗(yàn)P>0.05。免疫熒光結(jié)果顯示兩組分別有94.7%和95.3%的圓、亮、胞質(zhì)

5、折光度好的細(xì)胞c-kit染色陽(yáng)性。2、CSCs傳代貼壁后1天,免疫熒光結(jié)果示心肌細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性率分別為α-Actinin34%、cTnI58.8%、cTnT45.5%。共培養(yǎng)10天后,A組部分圓形、折光度好的細(xì)胞增殖明顯,有聚集生長(zhǎng)趨勢(shì)。且部分胞質(zhì)折光度好的細(xì)胞逐漸向棒狀、梭形、分支桿狀的幼稚心肌細(xì)胞樣形態(tài)轉(zhuǎn)變。B組CSCs數(shù)量逐漸減少,且細(xì)胞形態(tài)逐漸由圓、亮變化為長(zhǎng)梭形、條狀的成纖維樣細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果示各組細(xì)胞心肌細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性率分

6、別為,A組:α-Actinin87.0%、cTnI81.5%、cTnT80.5%(n=200);B組:α-Actinin76.5%、cTnI71.5%、cTnT70.0%(n=200)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:A、B兩組間各心肌特異性標(biāo)志物統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)x2檢驗(yàn),P值均小于0.05。且以上標(biāo)記物免疫熒光強(qiáng)度A組均強(qiáng)于B組細(xì)胞。全細(xì)胞膜片鉗分別成功封接到8個(gè)原代CSCs、12個(gè)A組和11個(gè)B組折光度好的細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行If電流(funnycurrent