重編程成纖維細胞定向神經(jīng)元分化的研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦損傷、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥、阿爾茨海默病、脊髓損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等的治療一直是醫(yī)學領域的難題。再生醫(yī)學的目的是創(chuàng)造相同類型的健康細胞以取代病變或損傷了的組織。這其中亟待解決的兩個主要問題是:適于移植的功能細胞類型較少;外源移植可能產(chǎn)生免疫排斥反應。隨著使用特定外源轉錄因子將成人成纖維細胞重編程為誘導性多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)這一技術取得成功，從

2、病人自體獲取可用于藥物篩選和移植治療的功能細胞將有可能成為現(xiàn)實。然而，對比iPS策略需將細胞命運退回到原始狀態(tài)再分化為其他類型細胞的方法，一條新的捷徑有可能被研發(fā)出來，即直接將一種成熟細胞轉換成另一種完全分化的細胞類型，而不必通過多能干細胞狀態(tài)。最近的一系列開創(chuàng)性工作表明，該方法是可行的，由三個轉錄因子Ngn3、Pdx1和Mafa組成的一個特定組合，可有效地在體內直接將成年小鼠胰腺外分泌細胞重編程分化為β-細胞樣細胞。在神經(jīng)細胞重編程過

3、程中，使用神經(jīng)細胞特異性的轉錄因子Pax6、Ngn2和Ascl1（又名Mash1），就可以將星形膠質細胞（astroglial cell）轉化成神經(jīng)元細胞。在神經(jīng)元前體細胞(neural progenitor)中表達Nurr1、Ngn2和Mash1則能夠獲得多巴胺能神經(jīng)元細胞(dopaminergic neuron)。因此，獲得大量可用于基礎研究及臨床應用的功能性神經(jīng)元細胞具有重要的科學和社會意義。上述這些方法只是在三個胚層定向發(fā)育的內

4、部實現(xiàn)了相互之間的細胞命運直接轉變，如果能實現(xiàn)細胞命運的跨系轉變，譬如將中胚層來源的細胞（如成纖維胞）直接轉變?yōu)橥馀邔觼碓吹募毎ㄈ缟窠?jīng)元細胞），就能在科學上突破發(fā)育譜系直接轉變的難題，并為直接誘導重編程策略的應用提供出更大的空間。將體細胞直接重編程產(chǎn)生功能細胞，可能會避免腫瘤的發(fā)生，這也將為體外建立疾病模型細胞用于藥物篩選，體內移植治療疾病或損傷提供出一條更安全的新途徑?，F(xiàn)階段，直接誘導重編程策略仍處于發(fā)展的起步階段，還留有許多科學問

5、題有待解決。
　　我們的研究思路是:是否可以將手術中脫落的皮膚細胞有效地轉換成為有功能的神經(jīng)元細胞，就能更加容易地獲得某類特定疾病的特定來源功能神經(jīng)元。既往的細胞重編程研究多數(shù)只限于在體外分析所獲功能細胞的特性，而對其在體內發(fā)揮的功能研究較少，特別是少有研究將這些重編程細胞移植到體內后去觀察它們在體內的變化和行為，這就無法回答一個重要的問題，即這些細胞在體內是否具有功能。
　　在本課題中，我們在前期鼠皮膚源性誘導式多潛能干細

6、胞制備的工作基礎上，使用三種轉錄因子將人頭皮的成纖維細胞轉變成具有功能的人誘導性神經(jīng)元細胞(human induced neuronal cells，hiNCs)，實現(xiàn)了誘導重編程的直接跨系轉變，并且將hiNCs移植到免疫缺陷小鼠的腦內，觀察發(fā)現(xiàn)移植的神經(jīng)元細胞能在宿主體內存活定植。本課題研究不僅完成了從病人自身直接獲取功能神經(jīng)元細胞的誘導轉變，也在體內外研究了該類細胞的特征和功能，所獲結果可能會為細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來一些新的啟

7、示。本課題共分以下二個部分。
　　第一部分 Ngn2、Ascl1和Sox2基因重編程人皮膚成纖維細胞為誘導性神經(jīng)元細胞的研究
　　研究目的:
　　在體外誘導重編程獲取人皮膚成纖維細胞來源的誘導性神經(jīng)元細胞(humaninduced neuronal cells，hiNCs)，研究這些細胞的生物學特征。
　　研究方法:
　　1.篩選與神經(jīng)細胞發(fā)育、分化相關的誘導因子，構建攜帶有轉錄因子的表達載體。
　　

8、2.收集培養(yǎng)頭皮成纖維細胞，載體轉染和產(chǎn)生人誘導性神經(jīng)元細胞(humaninduced neuronal cells, hiNCs)。
　　3.hiNCs的生物學特性鑒定和神經(jīng)電生理特征鑒定。
　　研究結果:
　　1.以標準皮膚細胞培養(yǎng)流程培養(yǎng)出人頭皮成纖維細胞，通過轉染含Ngn2、Ascl1和Sox2基因的慢病毒表達載體，獲得了具有神經(jīng)元形態(tài)和生理特征的hiNCs。
　　2.經(jīng)細胞免疫組織化學鑒定和電生理檢測，

9、證明該hiNCs具有與正常神經(jīng)元相似的生物學和生理學特征。
　　研究結論:
　　使用Ngn2、Ascl1和Sox2三個基因可將人成纖維細胞直接轉變成為具有神經(jīng)元細胞特征的人誘導性神經(jīng)元細胞。
　　第二部分誘導性神經(jīng)元細胞移植鼠腦內的研究
　　研究目的:
　　檢測誘導性神經(jīng)元細胞在移植進動物腦內后的生物學行為、特征和功能，為證明該類細胞在體內具有生理功能提供證據(jù)。
　　研究方法:
　　1.流式細胞

10、術篩選hiNCs，hiNCs移植于免疫缺陷小鼠腦內。
　　2.檢測hiNCs在宿主腦內的生理、生化特性。
　　研究結果:
　　1.經(jīng)流式細胞術分選，我們得到了約14.38％的PSA-NCAM+陽性細胞，這些細胞表達神經(jīng)元標志。
　　2.我們將hiNCs移植8周齡雄性小鼠的腦內，檢測到移植細胞在宿主腦內長期存活并表現(xiàn)出成熟神經(jīng)元的電生理特征。
　　研究結論:
　　人誘導性神經(jīng)元細胞(hiNCs)移植于免