人包皮成纖維細胞體外誘導重編程為多能干細胞的基礎研究.pdf

1、目的：本研究建立原代培養(yǎng)人包皮成纖維細胞（human postnatAlforeskin fibroblast hPFF）體系,絲裂霉素－C（Mitomycin C，MMC）處理hPFF制備人體組織來源細胞飼養(yǎng)層；將分別表達Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒顆粒感染hPFF，探討目的基因過表達慢病毒顆粒感染hPFF體外重編程為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell iPSC）的關鍵技

2、術。
　　 方法：（1）采用Ⅰ型膠原酶消化法結合組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hPFF，在倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，以臺盼藍染色檢測細胞活力、免疫細胞化學方法染色鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合法（Strept actividin-biotin complex SABC法）細胞鑒定。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法 (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-trazolium bromide

3、MTT法)測定細胞生長曲線。采用MMC處理hPFF制備細胞飼養(yǎng)層，MTT法篩選MMC作用的最佳濃度和時間；（2）將過表達綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的空病毒顆粒感染hPFF，在熒光倒置顯微鏡下觀察感染效率及熒光表達情況，探索最佳感染條件及感染復數(shù)（Multiplicity of infection，MOI值）；（3）將生長狀態(tài)良好的hPFF隨機分為3組：陰性對照組、含綠色熒光蛋白空病毒感染組

4、、目的基因感染組，采用含連續(xù)感染方式，在二次感染后4天給予hPFF干細胞培養(yǎng)條件,在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察其形態(tài)變化，拉曼光譜技術檢測三組細胞光譜，探索最佳培養(yǎng)條件。
　　 結果：（1）0.025％Ⅰ型膠原酶消化法結合組織塊培養(yǎng)法可以在體外建立穩(wěn)定的hPFF系，培養(yǎng)5d時即有細胞游走出，細胞呈長梭形、核仁明顯，7d時有較多的細胞游離出，匯集成束，10d左右細胞鋪滿瓶底，0.25％胰蛋白酶消化傳代。免疫細胞化學法SABC法鑒定細胞呈

5、陽性結果。絲裂霉素 C 10μg/ml作用3.5h或15μg/ml作用2.5h能抑制hPFF增殖,細胞在1周內維持穩(wěn)定的水平；(2)本實驗室培養(yǎng)條件下，慢病毒感染hPFF的最佳MOI值為40；（3）同等感染條件下，含綠色熒光蛋白空病毒感染組、陰性對照組的hPFF倒置顯微鏡下觀察形態(tài)未發(fā)生明顯改變，四個目的基因慢病毒混合感染組細胞偽足明顯收縮，形態(tài)由長梭形變?yōu)閳A形。拉曼光譜技術檢測也發(fā)現(xiàn)陰性對照組與含綠色熒光蛋白空病毒感染組光譜圖沒有明顯