15695.多順反子質(zhì)粒載體重編程脂肪間充質(zhì)干細胞為誘導(dǎo)多能干細胞

1、博士學(xué)位論文多順反子質(zhì)粒載體重編程脂肪間充質(zhì)干細胞為誘導(dǎo)多能干細胞Reprogrammingofhumanadiposemesenchymalstemcellstoinducedpluripotentstemcellsusingapolycistronicplasmid學(xué)號：1I塑121大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文摘要誘導(dǎo)多能干細胞(inducedpluripotentst

2、emcells，iPSCs)是通過向分化的體細胞轉(zhuǎn)入特定的外源轉(zhuǎn)錄因子進行重編程，從而獲得具有自我更新能力和多能性的細胞。iPSCs具有形成體內(nèi)所有細胞類型的潛能，尤其是能以患者自身體細胞制備iPSCs可用于特定疾病的治療，不但能解決干細胞臨床應(yīng)用所遇到的免疫排斥問題和倫理醫(yī)學(xué)等難題，而且在基礎(chǔ)研究、再生醫(yī)學(xué)以及藥理科學(xué)中也有著廣闊的發(fā)展前景和重要的意義。目前，iPSCs的來源主要是將細胞導(dǎo)入外源基因進行重編程而獲得。但是根據(jù)細胞種類的

3、不同，所采用的具體基因組合和轉(zhuǎn)基因方式各不相同，獲得的iPSCs的質(zhì)量也不盡相同，存在著安全性等方面的隱患。為提高產(chǎn)生iPSCs的安全性，本研究采用多順反子質(zhì)粒載體在無飼養(yǎng)層細胞條件下重編程脂肪間充質(zhì)干細胞(adiposederivedmesenchymalstemcells，ADSCs)獲得iPSCs，旨在為再生醫(yī)學(xué)的深入研究和應(yīng)用提供更安全便利的細胞源。首先，構(gòu)建了兩種多順反子質(zhì)粒載體plRES2OSKMEGFP和plRES2OSE

4、GFP。以分別實現(xiàn)四因子和兩因子多順反子質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人ADSCs的目標(biāo)。先以重疊PCR方法將酶切位點(EcoRI、SalI和BamHI)與具有自我剪切功能的2A元件(P2A、T2A和E2A)序列插入至Oct4、Sox2、Klf4和cMyc基因序列之間；再將各個基因片段連接(OcN—P2ASox2一T2AKlf4一E2AC—Myc，OSKM)構(gòu)建成單個開放閱讀框(openreadingframe，ORF)；最后以雙酶切、連接的方式插入pl

5、RES2EGFP質(zhì)粒載體，構(gòu)建成攜帶四因子的多順反子質(zhì)粒載體plRES2OSKMEGFP。隨后以NheI酶切plRES2一OSKMEGFP作為模板，利用PCR方法克隆Oct4一P2ASox2片段，再以重疊PCR方法在Oct4一P2ASox2序列兩端添加酶切位點NheI和SacI，然后以雙酶切、連接的方式插入plRES2EGFP質(zhì)粒載體，構(gòu)建成攜帶Oct4和Sox2兩個基因的多順反子質(zhì)粒載體plRES20SEGFP。經(jīng)過設(shè)計特異引物進行P

6、CR反應(yīng)和測序鑒定，證實所構(gòu)建的兩種多順反子質(zhì)粒載體序列正確。因此，本實驗成功采用2A元件構(gòu)建了兩種質(zhì)粒載體plRES2OSKM—EGFP和plRES2一OS—EGFP。然后，先使用構(gòu)建的四因子多順反子質(zhì)粒plRES2一OSKM—EGFP載體轉(zhuǎn)染人ADSCs，在無飼養(yǎng)層細胞條件下將其重編程為iPSCs。首先分離培養(yǎng)ADSCs，將傳代培養(yǎng)至第四代的ADSCs用plRES2OSKM—EGFP質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染一次，間隔4天后進行第二次轉(zhuǎn)染。光學(xué)顯