脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨組織誘導(dǎo)的新方法.pdf

1、研究背景:
　　脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是一種在脂肪組織中分離出來的多能干細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下，可以向脂肪、骨、軟骨等細(xì)胞類型分化。由于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化能力的證實，其作為軟骨工程種子細(xì)胞的研究越來越多。實驗證實，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在三維培養(yǎng)環(huán)境中高密度培養(yǎng)可以成軟骨誘導(dǎo)，但在單層培養(yǎng)誘導(dǎo)時無軟骨細(xì)胞生成，其中三維培養(yǎng)方法有微滴法，微團(tuán)法。有文獻(xiàn)報道，成體軟骨細(xì)胞單層高密度培養(yǎng)可以形成軟骨細(xì)胞膜片樣結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上，設(shè)想利用脂肪

2、間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后的細(xì)胞，再做單層高密度培養(yǎng)，觀察形成軟骨膜片的可行性，并進(jìn)一步觀察形成質(zhì)韌軟骨組織的可行性。探索脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)的新方法。
　　實驗?zāi)康?
　　將大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)在藻酸鹽凝膠中高密度培養(yǎng)成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后，將細(xì)胞自凝膠中釋放單層高密度培養(yǎng)，探索脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后的細(xì)胞形成軟骨組織的可行性。
　　實驗方法

3、:
　　取健康SD大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪組織，用0.1％Ⅰ型膠原酶將脂肪組織消化為單細(xì)胞懸液后離心，得到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞增殖達(dá)到融合時，用0.25％胰蛋白酶消化傳代后用流式細(xì)胞技術(shù)檢測間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CD44的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　將第6代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞以5×106/ml密度重懸于藻酸鈣凝膠中，形成脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞-藻酸鹽微珠，用含有軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞因子TGF-β1(transformi

4、nggrowthfactor-β1)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、維生素C的成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)2周。2周后將凝膠吹散釋放出成軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞，將得到的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化實驗，檢測大鼠軟骨特異性Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，以鑒定軟骨組織的生成。
　　將成軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞單層高密度培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，繼續(xù)以軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，觀察細(xì)胞的生長特點及是否有新生組織形成。探

5、索脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在藻酸鈣中成軟骨誘導(dǎo)后，單層高密度培養(yǎng)形成軟骨組織的可行性。
　　實驗結(jié)果:
　　大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞原代及傳代后呈梭形生長，傳代后的細(xì)胞呈規(guī)則排列漩渦狀生長。第6代次細(xì)胞形態(tài)仍無明顯改變，細(xì)胞傳代后細(xì)胞特性保持較為穩(wěn)定。大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD90、CD44陽性，說明其為間充質(zhì)干細(xì)胞來源。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞-藻酸鹽微珠成軟骨誘導(dǎo)2周后，釋放出的細(xì)胞行細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測軟骨特異性Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)