不同誘導(dǎo)條件對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化影響的研究.pdf

1、軟骨組織工程引入國(guó)內(nèi)的時(shí)間相對(duì)滯后，然而，上世紀(jì)90年代以來，軟骨組織取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，標(biāo)志性的事件是曹誼林團(tuán)隊(duì)在裸鼠背上構(gòu)建成功具有人外耳形態(tài)的軟骨。然而，近二十年以來組織工程的研究成果始終局限在實(shí)驗(yàn)室條件下，臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用步伐緩慢，已經(jīng)周知，體外構(gòu)建是軟骨組織工程應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵所在，在此進(jìn)程中存在諸多瓶頸亟待解決，其中有三個(gè)關(guān)鍵的問題：（1）種子細(xì)胞選擇：可以應(yīng)用與臨床轉(zhuǎn)化的軟骨種子如何選擇（2）種子細(xì)胞選擇后如何進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增：

2、如何通過體外擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量和良好生物活性的種子細(xì)胞（3）種子細(xì)胞體外軟骨誘導(dǎo)的技術(shù)穩(wěn)定性問題。
　　針對(duì)以上敘述的三個(gè)核心問題，本次研究選擇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為種子細(xì)胞，試圖解決BMSCs如何在體外進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增的問題。目前已知，可用于擴(kuò)增的種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)信息是組織工程實(shí)驗(yàn)得以實(shí)施的三個(gè)必要條件。其中，種子細(xì)胞的遴選篩選是最為核心的問題。適宜的種子細(xì)胞應(yīng)當(dāng)具有的基本特質(zhì)如下：a，來源廣泛，同時(shí)對(duì)供區(qū)及機(jī)體

3、影響輕微；b,有較強(qiáng)的被擴(kuò)增能力，適當(dāng)條件下可以誘導(dǎo)為不同的目的細(xì)胞；c，與支架材料能夠緊密貼服；d，對(duì)周圍環(huán)境變化耐受力強(qiáng)，適應(yīng)不同的應(yīng)力條件。到目前為止，可以作為種子細(xì)胞的細(xì)胞包括：軟骨細(xì)胞（來源：自體和異體）、干細(xì)胞（來源：脂肪、臍帶或骨髓）。在上述細(xì)胞中，用于軟骨組織工程研究時(shí)，骨髓可經(jīng)過常規(guī)的外科操作獲得，對(duì)供區(qū)組織的創(chuàng)傷小，骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，擴(kuò)增后可以得到滿足需求量的細(xì)胞用于構(gòu)建軟骨，目前，骨髓間充質(zhì)干

4、細(xì)胞作為種子細(xì)胞在體外的軟骨構(gòu)建，以及體內(nèi)的組織缺損修復(fù)，已經(jīng)在大動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了大量前瞻性實(shí)驗(yàn)研究，所以，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具備成為軟骨組織工程臨床應(yīng)用實(shí)現(xiàn)突破的條件，因此，本次實(shí)驗(yàn)選擇BMSCs作為研究對(duì)象。堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）是人體內(nèi)存在的要因子之一，主要功能是促細(xì)胞有絲分裂，除此之外，bFGF還能夠?qū)?xì)胞形態(tài)發(fā)生和分化產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，bFGF的生物學(xué)作用主要包括，促血管重建、促創(chuàng)傷愈合，以及參與組織創(chuàng)傷和缺損的修復(fù)等，近些年

5、來在軟骨組織工程中的應(yīng)用被不斷報(bào)道，本次實(shí)驗(yàn)研究了對(duì)BMSCs在體外擴(kuò)增過程中是否應(yīng)用bFGF，通過對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、成軟骨能力的比較得到相關(guān)結(jié)論：應(yīng)用bFGF，可在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得足夠數(shù)量的BMScs，其增殖能力強(qiáng)，并具有良好的成軟骨活性。我們還注意到，細(xì)胞體外增殖具有逐漸衰減的特性，隨著擴(kuò)增傳代數(shù)量的增加，細(xì)胞自身的擴(kuò)增和定向分化能力逐漸減弱。當(dāng)分別以高、低密度傳代時(shí)，傳代至同一代次，低密度傳代可獲得更多的數(shù)量，本論文在第二部

6、分通過比較高低密度傳代時(shí)其增殖、成軟骨能力的比較，為臨床應(yīng)用提供更多借鑒。通過bFGF的應(yīng)用以及傳代密度的控制可解決種子細(xì)胞的選擇以及大規(guī)模體外擴(kuò)增問題。
　　在BMSCs體外大規(guī)模擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，本論文第三、四部分探討B(tài)MSCs體外軟骨誘導(dǎo)的技術(shù)穩(wěn)定性問題。在體外利用BMSCs構(gòu)建特定形態(tài)的組織工程化軟骨，需要具備運(yùn)行穩(wěn)定、程序成熟的誘導(dǎo)體系。BMSCs接種支架材料后，需要在一定誘導(dǎo)條件下，向成軟骨細(xì)胞方向分化，該過程的影響因素眾

7、多，主要包括：誘導(dǎo)劑、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞空間分布結(jié)構(gòu)、應(yīng)力環(huán)境等。本輪文著重對(duì)支架材料中不同細(xì)胞接種濃度、不同起始誘導(dǎo)時(shí)間兩個(gè)重要因素進(jìn)行探討。通過比較BMSCs以30×106/ml、60×106/ml、90×106/ml的密度接種于PLA/PGA支架材料塊，BMSCs接種于PLA/PGA支架材料塊后分別于低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)1d、3d、5d后，加入成軟骨誘導(dǎo)液，進(jìn)行誘導(dǎo)后可知，60×106/ml的細(xì)胞濃度接種支架材料，接種后3d成軟骨誘導(dǎo)液

8、進(jìn)行誘導(dǎo)更利于組織工程軟骨的體外構(gòu)建，為BMScs體外軟骨誘導(dǎo)體系的建立提供重要依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線簡(jiǎn)介如下：（1）人髂骨處抽取骨髓3-5ml，洗滌、離心并吸取上次的脂肪后接種于培養(yǎng)皿中利用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組：每500ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，添加5ng bFGF；對(duì)照組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液不添加bFGF，分別進(jìn)行傳代培養(yǎng)，對(duì)第1、2、3、5代BMSCs做CCk8，生成細(xì)胞增殖曲線，并分別用第三代BMSCs做體外無支架材料軟骨

9、構(gòu)建，用Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)組織工程化軟骨特異性；（2）抽取骨髓做原代培養(yǎng)后，均用每500ml添加5ng bFGF的培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，分別以1:3、1:9比例進(jìn)行傳代，并用第1-7代細(xì)胞分別進(jìn)行體外無支架材料軟骨構(gòu)建，用Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)軟骨特異性；（3）抽取骨髓做原代培養(yǎng)后，用每500ml添加5ng bFGF的培養(yǎng)液、以1:3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用第3代細(xì)胞，分別以30×106/ml、60×106/ml、90

10、×106/ml的細(xì)胞密度接種于PLA/PGA支架材料塊，以成軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)8周后實(shí)施檢測(cè)，主要檢測(cè)項(xiàng)目包括濕重，番紅O（Safranin-o）染色，HE染色，Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)檢測(cè)，Ⅱ型膠原定量；（4）抽取骨髓做原代培養(yǎng)后，用每500ml添加5ng bFGF的培養(yǎng)液、以1:3比例進(jìn)行傳代、培養(yǎng)，用第3代細(xì)胞，以60×106/ml的濃度接種支架材料，分別用擴(kuò)增培養(yǎng)基培養(yǎng)1d、3d、5d后，加入成軟骨誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)8周后分別作相關(guān)檢

11、測(cè)，具體項(xiàng)目同前。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果簡(jiǎn)介如下：（1）bFGF對(duì)體外組織工程化軟骨構(gòu)建的影響：通過細(xì)胞增殖曲線可知，bFGF組1、2、3、5代細(xì)胞增殖能力高于非bFGF組；通過無支架組織工程軟骨構(gòu)建結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組顏色潔白、體積大于非bFGF組，軟骨特異性Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)檢測(cè)，顯示軟骨陷窩形成均勻，明顯優(yōu)于對(duì)照組。（2）不同細(xì)胞密度傳代對(duì)構(gòu)建的影響：細(xì)胞形態(tài)結(jié)果可知，BMSCs體外擴(kuò)增過程中，分別以1:3和1:9的比例進(jìn)行傳代，1

12、:3傳代組，BMSCs形態(tài)傳至第6代時(shí)仍能保持其梭形、紡錘形，傳至第8代時(shí)細(xì)胞分布、大小基本均勻，形態(tài)稍有鋪展并不無明顯變化，1:9傳代組，BMSC在第1、2、3代時(shí)形態(tài)梭形、紡錘形，形態(tài)鋪展不明顯，但在第4、5代時(shí)細(xì)胞數(shù)量極少且形態(tài)鋪展明顯；體外無支架組織工程軟骨構(gòu)建結(jié)果可知，1:3傳代組，分別用P1、P3、P5代的BMSCs進(jìn)行軟骨組織構(gòu)建所形成的組織塊，體積依次減小對(duì)比明顯，但Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)檢測(cè)差異不明顯，用P5、P6、P7

13、代的BMSCs進(jìn)行組織構(gòu)建時(shí)，所形成的組織塊體積差異不大，但Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，隨著接種代次的增加，其軟骨陷窩逐漸減少，其染色深度變淺，提示傳代至5后，隨著BMSCs接種代次增加，其Ⅱ型膠原的分泌量減小，在1:9傳代組，用P1、P2、P3代的BMSCs進(jìn)行軟骨組織構(gòu)建所形成的組織塊Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，均有均勻的軟骨陷窩形成，但第3代以后的BMSCs不能形成軟骨，提示低密度傳代時(shí)，3代以內(nèi)的BMSCs仍可用于組織工程軟

14、骨體外構(gòu)建；（3）支架材料中不同細(xì)胞接種濃度對(duì)體外組織工程化軟骨構(gòu)建的影響：支架材料中以30×106/ml、60×106/ml、90×106/ml三種不同細(xì)胞密度接種時(shí)，體積和厚度依次是60×106/ml組、90×106/m組、30×106/ml，其番紅O（Safranin-O）染色、HE染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)檢測(cè)提示，60×106/ml組軟骨陷窩分布均勻，染色厚重度明顯高于90×106/m組和30×106/ml組，但90×106

15、/m組和30×106/ml組并無明顯差異；（4）不同起始誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)體外組織工程化軟骨構(gòu)建的影響：在BMSCs接種到支架材料分別培養(yǎng)1d、3d、5d后開始加軟骨誘導(dǎo)液進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，所形成組織塊的大體觀中，以3d組最厚，1d和5d組所形成組織塊透明度明顯，其番紅O（Safranin-O）染色、HE染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，3d組軟骨陷窩數(shù)量多、分布最均勻，染色厚重度亦明顯高于1d和5d組。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)緊緊圍

16、繞制約組織工程化軟骨實(shí)施臨床應(yīng)用面臨的三個(gè)主要問題，選擇BMSCs作為種子細(xì)胞作為研究對(duì)象，分別通過對(duì)體外擴(kuò)增過程中是否應(yīng)用bFGF、體外擴(kuò)增過程中高低密度傳代對(duì)BMSCs體外增殖和成軟骨能力進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，通過應(yīng)用bFGF以及傳代密度控制可獲取足夠數(shù)量和生物活性的種子細(xì)胞，從而解決種子細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增的問題。本論文第三、四部分分別通過對(duì)支架材料中30×106/ml、60×106/ml、90×106/ml三種不同細(xì)胞接種、接種后1