人成纖維細胞轉分化形成神經元前體細胞的研究.pdf

1、神經退行性疾病(Neurodegenerative disease)是大腦或脊髓的神經細胞的結構和功能喪失導致的神經疾病，如:阿茲海默癥、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥和脊髓側索硬化癥等，對人類特別是老年人的健康構成了巨大的威脅。人們試圖通過化學藥物治療這些疾病，但都沒有取得好的效果。于是，人們嘗試通過細胞移植治療的方法修復受損神經元。到目前為止，已經有多種細胞通過移植實驗被證明對神經修復具一定作用，如多能性干細胞(PSCs)、造血干細胞(HS

2、Cs)、間充質干細胞(MSCs)、神經干細胞(NSCs)、限制性神經元前體細胞(NRPs)、特定的神經元(specialneurons)等。
　　由于多能性干細胞具有自我更新和分化為各種細胞類型的能力，然而這類細胞分化方向難以控制，直接注射到體內易形成畸胎瘤，所以并不適合直接用于臨床治療。造血干細胞、間充質干細胞和神經干細胞是成體中存在的，并且研究得最深入的三類成體干細胞。造血干細胞和間充質干細胞在一定條件下可表達神經細胞相關基因

3、，因此臨床前研究常使用這兩類干細胞進行神經退行性疾病的治療。然而，這兩類干細胞在體內轉分化成為神經細胞的效率非常低，對神經系統(tǒng)疾病的治療作用并不十分明顯。神經干細胞或神經前體細胞(NPs)為多能(mutipotent)細胞，可以分化產生神經系統(tǒng)兩類主要的細胞:神經元(neurons)和神經膠質細胞(glialcells)。但細胞移植實驗發(fā)現(xiàn)，神經干細胞在體內更易分化成神經膠質細胞，而不是形成功能性神經元。所以NSCs的移植治療效果也不理

4、想。功能性神經元理論上可以用于因特定神經元損傷造成的神經系統(tǒng)疾病。但由于神經元屬于終末分化細胞，不具有分裂增殖能力，難以獲得足夠用于治療的神經元。并且，神經細胞直接移植到大腦中，其成活率和整合率都比較低，從而限制了它臨床應用的可操作性。
　　在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中，存在另一個主要的細胞類型，即限制性神經元前體細胞(Neuronal restricted progenitors，NRPs)，簡稱神經元前體細胞。它由神經前體細胞進一步分

5、化產生，具有一定自我更新能力和神經元系(Neuronal lineage)分化能力，在成體大腦中有遷移能力，并進一步特異地分化形成功能性神經元。NRP細胞是神經干細胞和神經元的一個過渡中間體，相比于神經干細胞，神經元前體細胞的分化能力被進一步限制，僅特異地分化為神經元，而不會分化形成膠質細胞。神經元前體細胞被認為在神經系統(tǒng)的自我修復過程中起著重要作用，利用其進行神經退行性疾病的治療將更加安全有效。然而，從正常的神經組織中獲取神經元前體細

6、胞非常困難，從而阻止其在臨床進一步應用。因此我們希望通過轉分化技術將常見的成纖維細胞直接誘導為神經元前體細胞，從而獲得大量的用于治療的細胞。
　　轉分化技術是指在體外培養(yǎng)條件下，通過轉基因方法將一種成體細胞類型直接誘導為另一種成體細胞類型的技術。與體細胞重編程相比，轉分化技術從誘導到移植治療的過程相對簡單，所需的時間較短，且成本較低。
　　在本課題中，我們從已知的在誘導神經元和神經干細胞過程中起著重要作用的基因中篩選出8個基

7、因:Sox2、c-Myc、Klf4、TLX、Bmi1、BRN2、hBRN4和hFoxG1，將它們分別包裝到慢病毒顆粒中，并將這些慢病毒混合在一起，感染人胎兒成纖維細胞。經過11-12天的誘導后，成纖維細胞增殖并形成緊實的細胞集落。通過不同因子組合誘導實驗，我們發(fā)現(xiàn)這8個基因中，只需要3個因子Sox2，c-Myc加上hBRN2或hBRN4的一種，就足以誘導獲得大量細胞集落。在低氧條件下，僅需7天就可以形成細胞集落。這些細胞體積小，增殖快，

8、并且一些細胞克隆在鋪有Matrigel的培養(yǎng)皿中可以穩(wěn)定培養(yǎng)30代以上。經鑒定發(fā)現(xiàn)神經細胞標記Nestin被大量激活。在無血清神經元誘導培養(yǎng)基中，細胞分化形成神經元的形態(tài)，并表達神經元標記基因Tuj1。而在含血清的膠質細胞誘導培養(yǎng)基中，細胞并不形成GFAP陽性的膠質細胞。由此我們猜測這些細胞為為神經樣特異性前體細胞(hiNRPs)，而不是神經干細胞。為進一步證實這種假設，我們通過全基因表達分析證明這類細胞的基因表達模式已經完全不同于成纖

9、維細胞。而利用反轉錄PCR、熒光定量PCR和免疫熒光實驗鑒定發(fā)現(xiàn)這類細胞表達Sox2、Nestin、MSI1、CD133、N-CAM、DCX、Tuj1和MAP2等神經元前體細胞的標記，也表達增殖標記基因Ki-67和趨化因子受體CXCR4，而不表達OCT4、PAX6、GFAP和NeuN，證明這些誘導獲得的hiNPR細胞中不含胚胎干細胞、神經干細胞、膠質細胞和成熟神經元。體內和體外分化實驗證實，hiNRPs能分化為多種特定功能性神經元，而不