RA與WNT信號通路聯(lián)合調(diào)節(jié)神經(jīng)元前體細胞分化的體外研究.pdf

1、神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)是一種具有自我更新，自我增殖和分化成多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞潛力的未分化的細胞，經(jīng)過神經(jīng)元前體細胞(neural progenitor cells,NPCs)和膠質(zhì)前體細胞階段，最終分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。體外培養(yǎng)NPCs時，表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth

2、 factor,bFGF)具有促進增殖的作用，并最終使NPCs增殖形成具有分化潛能的神經(jīng)球；若撤去促進增殖的因素時，神經(jīng)球?qū)只缮窠?jīng)元、星型膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞；因此對于 NPCs研究的重點就在如何控制 NPCs向預定的細胞方向分化，并達到對疾病治療的目的。在神經(jīng)球的培養(yǎng)中，許多細胞內(nèi)源性的和外源性的因素均可調(diào)節(jié) NPCs的增殖、遷移和分化；NPC培養(yǎng)技術(shù)為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供了一個較為理想和可行的細胞培養(yǎng)模型；通過對胚胎、胎兒

3、或者成年機體獲得的 NSCs予以適當誘導，然后進行移植治療，對于損傷或疾病所導致的大腦和脊髓的神經(jīng)元變性或許會得到逆轉(zhuǎn)。
　　維甲酸(retinoic acid,RA)是一個由維生素A轉(zhuǎn)化而來的親脂性的小分子化合物，在胚胎形成，發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞，在給予 RA刺激時會促進干細胞增殖；對于發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，RA促進干細胞向著膠質(zhì)細胞前體細胞方向的分化以及少突膠質(zhì)-GABA能神經(jīng)元方向的

4、分化。Wnt信號通路是器官發(fā)育過程中高度保守的信號通路。不論是在胚胎的神經(jīng)發(fā)生，還是在成年神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞，Wnt信號均具有調(diào)節(jié)NPCs分化和增殖的作用；對于神經(jīng)變性性和神經(jīng)退行性疾病，Wnt信號同樣扮演著十分重要的角色；通過對體外培養(yǎng)的胚胎干細胞進行Wnt配體刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt除了能促進干細胞增殖和自我更新，促進神經(jīng)球的形成和增長之外，還具有促進其向GABA能神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞方向的分化的潛能。在發(fā)育中，RA和Wnt信號通常作為腹、背

5、兩極的形態(tài)發(fā)生信號，協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)著組織的生長和肝細胞的分化，因此，在神經(jīng)干細胞中，二者有可能協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的增殖分化。
　　但有關(guān)RA和Wnt信號相互影響及其相互之間在神經(jīng)干細胞的增殖與分化中相互作用機制的研究目前尚未見報道?；诖耍緦嶒灁M在體外培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞的基礎上，研究兩者共同干預NSCs時，會對NSCs的自我更新和增殖產(chǎn)生什么樣的影響？
　　第一部分、RA和Wnt信號對神經(jīng)干細胞增殖分化的影響
　

6、　1.方法：
　　培養(yǎng)離體胚胎神經(jīng)干細胞；在神經(jīng)干細胞的誘導分化下，進行RA處理、Wnt3a處理以及兩者聯(lián)合；采用 BrdU示蹤方法檢測神經(jīng)干細胞增殖能力的變化；采用免疫細胞化學染色和Western Blot技術(shù)觀察少突膠質(zhì)-GABA能神經(jīng)元共同前體細胞標記蛋白DLX2，少突膠質(zhì)前體細胞標記蛋白NG2，GABA能神經(jīng)元標記蛋白GAD67，神經(jīng)元特異性標記蛋白TUJ1，以及星型膠質(zhì)細胞標記蛋白GFAP表達的變化。
　　2.結(jié)果

7、：
　　RA和Wnt3a單獨處理時，均可顯著增加BrdU陽性的神經(jīng)干細胞、GABA能神經(jīng)元的GAD67陽性的細胞的數(shù)目以及TUJ1陽性的神經(jīng)元細胞（P<0.05）；Wnt3a可增加少突膠質(zhì)-GABA能神經(jīng)元的共同前體細胞即Dlx2陽性和少突膠質(zhì)前體細胞即NG2陽性的細胞和細胞數(shù)量（P<0.05），然而RA抑制Dlx2和NG2的表達（P<0.05）。RA和Wnt3a聯(lián)合使用時，抑制神經(jīng)干細胞增殖，降低Dlx2,NG2，GAD67以及

8、TUJ1神經(jīng)細胞標記物的表達。在神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞方向的分化時，RA和Wnt3a均不同程度地抑制神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞方向的分化（P<0.05），而兩者聯(lián)合使用時GFAP陽性的星型膠質(zhì)細胞數(shù)目則有回到了對照組的水平。
　　3.結(jié)論：
　　RA和Wnt3a均可促進神經(jīng)干細胞增殖和向少突膠-GABA能神經(jīng)元方向的分化的作用，同時抑制其向星形膠質(zhì)細胞方向的分化；RA和Wnt3a聯(lián)合使用時，神經(jīng)干細胞增殖、分化能力又恢復到了

9、對照組的水平，提示RA和Wnt信號之間可能存在相互拮抗的特性。
　　第二部分、RA和Wnt信號之間的相互作用及β-catenin對RA/Wnt相互拮抗作用的挽救
　　1.方法：
　　培養(yǎng)離體胚胎神經(jīng)干細胞，采用過表達β-catenin的慢病毒感染神經(jīng)干細胞，然后進行神經(jīng)干細胞的誘導分化，如實驗第一部分方法所述采用BrdU增殖實驗檢測神經(jīng)干細胞自我增殖能力的變化，采用免疫細胞化學染色檢測DLX2，NG2,GAD67以及G

10、FAP的變化,采用Western Blot技術(shù)檢測RA信號通路和Wnt信號通路中相關(guān)蛋白的表達。
　　2.結(jié)果：
　　RA可上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路神經(jīng)干細胞中的關(guān)鍵分子β-catenin，以及Wnt信號的靶基因Axin2和Cyclin D1的表達；Wnt3a在RA信號通路中則可上調(diào)RA降解過程中的關(guān)鍵酶cyp26B1和下調(diào)RA信號的胞內(nèi)關(guān)鍵分子Raldh3的表達。RA和Wnt3a共同刺激抑制β-catenin

11、的表達。與RA/Wnt3a聯(lián)合刺激相比，β-catenin過表達刺激可明顯增加少突膠質(zhì)細胞-GABA能神經(jīng)元的共同前體細胞即Dlx2陽性的細胞，少突膠質(zhì)前體細胞即NG2陽性的細胞和GABA能神經(jīng)元的GAD67陽性的細胞的數(shù)目以及TUJ1陽性的神經(jīng)元細胞（P<0.05）和BrdU標記的神經(jīng)干細胞（P<0.05）；而對于神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞方向的分化出現(xiàn)一定程度的下降，提示β-catenin過表達可挽救RA與Wnt信號在神經(jīng)干細胞中的相