重組人促紅細胞生成素誘導(dǎo)人源羊水干細胞向心肌前體細胞的分化及其Wnt信號通路機制的研究.pdf

1、目的：
　　觀察不同濃度重組人促紅細胞生成素(recombinant humanerythropoietin，rhEPO)對人源羊水干細胞(amniotic fluid stem cells，AFSC)向心肌前體細胞分化的作用及觀察該分化過程中可能參與的Wnt信號機制。
　　方法：
　　(1)擴增、純化AFSC。
　　(2)倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的羊水干細胞的一般生物學(xué)特性。采用流式細胞術(shù)檢測AFSC的CD29

2、及CD34的表達情況。
　　(3)本實驗分為對照組，rhEPO組，rhEPO+LiCl組。
　　(4)對照組一直使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；rhEPO組用對照組的培養(yǎng)基中加入rhEPO組成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，且rhEP0的終濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0U/ml，干預(yù)24h后換成與對照組相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)；rhEPO+LiCl組用上述濃度的rhEPO組成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)并在誘導(dǎo)分化液中各加上5mmol/L的wnt信號激動劑

3、LiCl干預(yù)24h，然后換成與對照組相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　(5)將鑒定后的細胞種于10*10的小玻片上，按上述要求進行干預(yù)，48h后，用免疫熒光法檢測羊水干細胞在誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)早期的促紅細胞生成素受體(EPOR)的表達情況。用免疫組化檢測β-catenin及p-GSK-3β(ser9)的表達情況。
　　(6)2周后在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化后的細胞，計算有形態(tài)改變的心肌前體細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比率為分化率，并比較rhEPO組與

4、對照組的分化率的差異。
　　(7)14天后收集各組細胞，提取總的RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測各組心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表達情況。
　　(8)28天后應(yīng)用Western blot檢測各組細胞心肌特異蛋白(β-MHC、cTnT)的表達情況。
　　結(jié)果：
　　(1)羊水內(nèi)的細胞接種后原代靜養(yǎng)7天，第8天在倒置顯微鏡下可見集落細胞團，集落分布不均，大小不一，集落周邊僅有很少量細胞，集落中心

5、細胞易可見老化凋亡的細胞。羊水干細胞生長快，傳代后細胞平鋪時體積大，核仁大，胞漿豐富，細胞生長較密時，細胞似成纖維樣細胞，排列成漩渦狀。
　　(2)AFSC經(jīng)流式細胞儀檢測顯示AFSC表型為CD29+為97.04％，CD34+為0.61％。
　　(3)免疫熒光觀察到AFSC在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)早期均有EPOR的表達。
　　(4)誘導(dǎo)分化第14天，倒置顯微鏡下可見細胞由長梭形逐漸變短增寬，相鄰的細胞間有融合現(xiàn)象，似類肌管樣結(jié)構(gòu)

6、。不同濃度的rhEPO誘導(dǎo)的分化率有差異，但都顯著高于對照組(P<0.05)，且以5.0U/mLrhEPO的誘導(dǎo)分化率最高(P<0.05)。
　　(5)在誘導(dǎo)分化14天后，與未干預(yù)組比較，各濃度rhEPO組及各濃度rhEPO+LiCl組干預(yù)后細胞的GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表達明顯上調(diào)(P<0.05)，以5.0 U/ml的作用最顯著；與rhEPO組比較，rhEPO+Licl組能顯著干預(yù)上調(diào)誘導(dǎo)細胞的GATA-4、Nkx

7、2.5mRNA的表達(P<0.05)，以5.0 U/ml rhEPO+5mmol/L的LiCl干預(yù)作用最強。
　　(6)經(jīng)誘導(dǎo)28天后，各干預(yù)組的細胞的心肌特異相關(guān)蛋白β-MHC、cTnT的表達明顯上調(diào)(P<0.05)，以5.0 U/ml的作用最顯著，而rhEPO與Wnt信號激動劑共同作用強于單用rhEPO。
　　(7)誘導(dǎo)過程中各組均有如前所述的Wnt信號通路中的蛋白表達，與對照組比較，rhEPO及rhEPO+LiCl組β

8、-catenin及p-GSK-3β的表達的增多(P<0.05)，與rhEPO比較，rhEPO+LiCl組β-catenin p-GSK-3β的表達強于rhEPO組。
　　結(jié)論：
　　(1)人源羊水中存在AFSC，其性質(zhì)類似于間充質(zhì)干細胞及胚胎干細胞。
　　(2)外源性rhEPO成素能作為一種化學(xué)誘導(dǎo)劑應(yīng)用于干細胞的研究。
　　(3)外源性rhEPO早期干預(yù)能劑量依賴性促進人源羊水干細胞向心肌前體細胞分化。