重組人促紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)人源羊水干細(xì)胞向心肌前體細(xì)胞的分化及其Wnt信號(hào)通路機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　觀察不同濃度重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant humanerythropoietin，rhEPO)對(duì)人源羊水干細(xì)胞(amniotic fluid stem cells，AFSC)向心肌前體細(xì)胞分化的作用及觀察該分化過(guò)程中可能參與的Wnt信號(hào)機(jī)制。
　　方法：
　　(1)擴(kuò)增、純化AFSC。
　　(2)倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的羊水干細(xì)胞的一般生物學(xué)特性。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AFSC的CD29

2、及CD34的表達(dá)情況。
　　(3)本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，rhEPO組，rhEPO+LiCl組。
　　(4)對(duì)照組一直使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；rhEPO組用對(duì)照組的培養(yǎng)基中加入rhEPO組成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，且rhEP0的終濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0U/ml，干預(yù)24h后換成與對(duì)照組相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)；rhEPO+LiCl組用上述濃度的rhEPO組成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)并在誘導(dǎo)分化液中各加上5mmol/L的wnt信號(hào)激動(dòng)劑

3、LiCl干預(yù)24h，然后換成與對(duì)照組相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　(5)將鑒定后的細(xì)胞種于10*10的小玻片上，按上述要求進(jìn)行干預(yù)，48h后，用免疫熒光法檢測(cè)羊水干細(xì)胞在誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)早期的促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)的表達(dá)情況。用免疫組化檢測(cè)β-catenin及p-GSK-3β(ser9)的表達(dá)情況。
　　(6)2周后在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞，計(jì)算有形態(tài)改變的心肌前體細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比率為分化率，并比較rhEPO組與

4、對(duì)照組的分化率的差異。
　　(7)14天后收集各組細(xì)胞，提取總的RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表達(dá)情況。
　　(8)28天后應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞心肌特異蛋白(β-MHC、cTnT)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　(1)羊水內(nèi)的細(xì)胞接種后原代靜養(yǎng)7天，第8天在倒置顯微鏡下可見(jiàn)集落細(xì)胞團(tuán)，集落分布不均，大小不一，集落周邊僅有很少量細(xì)胞，集落中心

5、細(xì)胞易可見(jiàn)老化凋亡的細(xì)胞。羊水干細(xì)胞生長(zhǎng)快，傳代后細(xì)胞平鋪時(shí)體積大，核仁大，胞漿豐富，細(xì)胞生長(zhǎng)較密時(shí)，細(xì)胞似成纖維樣細(xì)胞，排列成漩渦狀。
　　(2)AFSC經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示AFSC表型為CD29+為97.04％，CD34+為0.61％。
　　(3)免疫熒光觀察到AFSC在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)早期均有EPOR的表達(dá)。
　　(4)誘導(dǎo)分化第14天，倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸變短增寬，相鄰的細(xì)胞間有融合現(xiàn)象，似類肌管樣結(jié)構(gòu)

6、。不同濃度的rhEPO誘導(dǎo)的分化率有差異，但都顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且以5.0U/mLrhEPO的誘導(dǎo)分化率最高(P<0.05)。
　　(5)在誘導(dǎo)分化14天后，與未干預(yù)組比較，各濃度rhEPO組及各濃度rhEPO+LiCl組干預(yù)后細(xì)胞的GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，以5.0 U/ml的作用最顯著；與rhEPO組比較，rhEPO+Licl組能顯著干預(yù)上調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞的GATA-4、Nkx

7、2.5mRNA的表達(dá)(P<0.05)，以5.0 U/ml rhEPO+5mmol/L的LiCl干預(yù)作用最強(qiáng)。
　　(6)經(jīng)誘導(dǎo)28天后，各干預(yù)組的細(xì)胞的心肌特異相關(guān)蛋白β-MHC、cTnT的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，以5.0 U/ml的作用最顯著，而rhEPO與Wnt信號(hào)激動(dòng)劑共同作用強(qiáng)于單用rhEPO。
　　(7)誘導(dǎo)過(guò)程中各組均有如前所述的Wnt信號(hào)通路中的蛋白表達(dá)，與對(duì)照組比較，rhEPO及rhEPO+LiCl組β

8、-catenin及p-GSK-3β的表達(dá)的增多(P<0.05)，與rhEPO比較，rhEPO+LiCl組β-catenin p-GSK-3β的表達(dá)強(qiáng)于rhEPO組。
　　結(jié)論：
　　(1)人源羊水中存在AFSC，其性質(zhì)類似于間充質(zhì)干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞。
　　(2)外源性rhEPO成素能作為一種化學(xué)誘導(dǎo)劑應(yīng)用于干細(xì)胞的研究。
　　(3)外源性rhEPO早期干預(yù)能劑量依賴性促進(jìn)人源羊水干細(xì)胞向心肌前體細(xì)胞分化。