h-MSCs的體外培養(yǎng)及向神經元樣細胞分化的研究.pdf

1、目的：采用體外分離、培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞(human Mesenchymal stem cells,h-MSCs),以及用堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和不同濃度的睫狀神經節(jié)神經營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)對其進行預誘導及誘導,通過觀察細胞形態(tài)學變化,及免疫細胞化學染色 CD34、CD44、CD54、NSE和Nestin的

2、表達,探討建立一種較簡便有效的體外擴增培養(yǎng)h-MSCs的體系,以及CNTF對h-MSCs分化為神經元樣細胞的誘導作用和適宜的誘導濃度。
　　方法：骨髓來源于南華大學附屬第二醫(yī)院和第一醫(yī)院血液內科行骨髓穿刺檢查患者(經患者同意),已排除腫瘤、傳染病及血液系統(tǒng)疾病,年齡18～55歲,性別不限,男39例,女29例,共68例。采用密度梯度離心法和全骨髓貼壁法相結合的方法,分離獲得h-MSCs,利用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基體外擴增,以

3、及細胞凍存、復蘇。相差倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化,并繪制第1、3、6代h-MSCs的生長曲線。取傳至第3代的h-MSCs,分為4組進行誘導分化:實驗組、單純預誘導組、單純誘導組和空白對照組。實驗組以bFGF預誘導24h后,再以5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL濃度梯度的CNTF誘導12h;單純預誘導組僅行bFGF預誘導而無CNTF誘導;單純誘導組不經bFGF預誘導僅行CNTF誘導,誘導液中的CNTF亦分為3個濃度梯度(5n

4、g/mL、10ng/mL和20ng/mL);空白對照組為無處理組,既無bFGF預誘導亦無CNTF誘導。應用免疫細胞化學技術對培養(yǎng)的h-MSCs進行CD34、CD44和CD54鑒定及對誘導分化后的細胞進行NSE和Nestin鑒定。
　　結果：
　　1.h-MSCs在體外培養(yǎng)條件下,呈長梭形,類似成纖維細胞,可穩(wěn)定增值傳代并可凍存復蘇,復蘇后細胞生長特性與凍存前的細胞相似;
　　2.第1、3、6代h-MSCs生長曲線呈“S

5、”形。第1代與第3代的細胞濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.704),第1代與第6代比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.132),第3代與第6代比較差異亦無統(tǒng)計學意義(P=0.256);
　　3.應用免疫細胞化學技術檢測培養(yǎng)的h-MSCs,顯示 CD44,CD54均呈陽性表達,CD34表達呈陰性;
　　4.h-MSCs在bFGF預誘導24h后,細胞形態(tài)基本無改變。CNTF誘導5h后部分細胞體積變小,以細胞核為中心收縮,逐漸呈錐形,

6、形成突起。CNTF誘導12h后,實驗組中10ng/mLCNTF組和20ng/mLCNTF組細胞形態(tài)改變明顯,有2個或多個細長突起,類似神經元;5ng/mLCNTF亞組僅有少部分細胞形態(tài)稍發(fā)生變化?？瞻讓φ战M、單純預誘導組和單純誘導組的細胞形態(tài)基本無改變,仍為寬大扁平的梭形。
　　5.免疫細胞化學檢測顯示誘導后的細胞神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和巢蛋白(Nestin)均呈陽性表達。各

7、組陽性細胞率間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(F=98.822,F=105.395,均P<0.01);實驗組與空白對照組、單純預誘導組及單純誘導組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均 P<0.01),但后三組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(均 P>0.01);實驗組內兩兩之間比較顯示,20ng/mL組與10ng/mL組陽性細胞率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.413,P=0.496),但均高于5ng/mL組(均 P<0.01)。10ng/mLCNTF實驗組 NS

8、E陽性細胞率(46.38±4.99)％,Nestin陽性細胞率(45.76±4.46)%,為最多。
　　結論：
　　1.梯度離心法和全骨髓貼壁法相結合的方法,是一個較簡便有效的體外 h-MSCs培養(yǎng)、純化體系;
　　2.h-MSCs可在體外培養(yǎng)擴增,并可凍存、復蘇,復蘇后的細胞生長特性與凍存前的細胞相似;
　　3.在本實驗條件下,CNTF可誘導 h-MSCs定向分化為神經元樣細胞;且10ng/mLCNTF可能為較