EGFP示蹤兔BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：采用脂質(zhì)體法將含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的MmiR3407-MR03重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived stroma cells，BMSCs）得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP基因的BMSCs系，再用睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）定向誘導(dǎo)分化，以探討EGFP基因標(biāo)記對(duì)兔

2、 BMSCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞等生物學(xué)特性的影響，以期為BMSCs的體內(nèi)移植提供有效的示蹤方法。
　　方法：選用新生新西蘭白兔，取其骨髓用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)，通過(guò)傳代將 BMSCs擴(kuò)增純化。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)兔 BMSCs的CD34、CD44、CD54抗體的表達(dá)情況。按照高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒DNA。確定G418的最佳篩選濃度后選取第3-5代兔BMSCs，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)

3、行轉(zhuǎn)染，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 EGFP基因的兔BMSCs，并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。取第3-5代的EGFP-BMSCs和第3-5代的BMSCs，分為四組：EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組。EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs誘導(dǎo)組均先用10ng/mlbFGF預(yù)誘導(dǎo)24h，再用10ng/mlCNTF誘導(dǎo)12h；EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組均無(wú)特殊處理

4、。觀察四組細(xì)胞形態(tài)變化，采用MTT法檢測(cè)四組細(xì)胞活性，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)四組細(xì)胞的巢蛋白（nestin）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NES)的表達(dá)情況，并比較兩誘導(dǎo)組之間、兩空白組之間及各細(xì)胞誘導(dǎo)前后組之間細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞活力及神經(jīng)元特異性標(biāo)記物陽(yáng)性細(xì)胞率。
　　結(jié)果：
　　1.原代兔BMSCs貼壁生長(zhǎng)，多呈紡錘形，漩渦樣生長(zhǎng)。傳代后細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致，以梭形為主，胞體飽滿，排列更加有序。傳至10代，細(xì)胞逐漸老化。

5、>　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果顯示所培養(yǎng)細(xì)胞的CD44, CD54呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD34表達(dá)呈陰性，符合BMSCs的免疫表型特點(diǎn)。
　　3.脂質(zhì)體介導(dǎo)含 EGFP基因的MmiR3407-MR03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BMSCs后，轉(zhuǎn)染12 h，熒光顯微鏡下可觀察到少量細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)染48h時(shí)轉(zhuǎn)染率最高，近30％，之后72h內(nèi)隨時(shí)間變化不大。經(jīng)G418篩選后可得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的BMSCs系。
　　4.CN TF誘導(dǎo)12 h后，可

6、見細(xì)胞胞體伸出2個(gè)或多個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起，折光性強(qiáng)，類似神經(jīng)元形態(tài)，熒光顯微鏡下仍可見明亮的綠色熒光。MTT法結(jié)果顯示：24h、48h和72h BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs空白組、BMSCs空白組的OD值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；
　　5.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組的NSE陽(yáng)性細(xì)胞率、nestin陽(yáng)性細(xì)胞率分別為（49.98?3.07）%、（48.74?1.32）%；

7、BMSCs誘導(dǎo)組的NSE陽(yáng)性細(xì)胞率、nestin陽(yáng)性細(xì)胞率分別為（48.44?3.97）%、（47.86?1.68）%；EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組的NSE、nestin陽(yáng)性細(xì)胞率均較小。EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs誘導(dǎo)組兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs空白組兩組間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0

8、.05）；EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs空白組兩組間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)脂質(zhì)體法可得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs系，EGFP基因標(biāo)記可能為BMSCs移植提供一種有效的示蹤方法；
　　2.EGFP基因標(biāo)記的兔BMSCs可誘導(dǎo)分化分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，其生物學(xué)特性無(wú)影響；
　　3.睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子干預(yù)后穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs可定向分化為神經(jīng)