酒精對神經(jīng)前體細(xì)胞的作用及細(xì)胞內(nèi)信號通路的影響.pdf

1、一、背景： 患有酒精綜合癥(fetal alcohol syndrome)的兒章是在胚胎期和(或)哺乳期由母親過量飲酒行為引起，有明顯小于健康兒童的大腦及其他畸形。為研究在胎兒期大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞在增殖、分化過程中受酒精損傷的原理，用培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞(neural progenitor cells)建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以研究酒精對生長因子刺激引起神經(jīng)前體細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增的影響。該模型的建立可幫助了解酒精綜合癥對神經(jīng)系統(tǒng)(central nervo

2、us system，CNS)損傷的機(jī)制，為保護(hù)暴露于酒精危害下胎兒的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育提供預(yù)防及治療的科學(xué)依據(jù)。 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，為體外研究神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化特性及神經(jīng)干細(xì)胞損傷保護(hù)提供了重要的實(shí)驗(yàn)手段。國外已有報道貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的方法，與傳統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)相比，更適于研究酒精對神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、分化的影響，如免疫熒光染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)等。 另外，在神經(jīng)干細(xì)胞

3、克隆球超微結(jié)構(gòu)觀察中發(fā)現(xiàn)，在克隆球中相鄰的兩個細(xì)胞膜之間有成片的連接，有2-4nm狹窄的縫隙，為間隙連接(gap junction)。構(gòu)成這種細(xì)胞間通道的蛋白質(zhì)分子被稱為連接蛋白(connexin)或者連接子(connexon)。連接蛋白基因是一個多基因家族，與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。確定神經(jīng)干細(xì)胞克隆球細(xì)胞之間連接蛋白的類型，可幫助了解神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)發(fā)育過

4、程中間隙連接的演變過程及其規(guī)律。 國外新近報道，神經(jīng)前體細(xì)胞株在分化過程中能夠分泌某種抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的因子。本試驗(yàn)對神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中產(chǎn)生的衍生物對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用作了初步的探討，為今后治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供新的思路和方法。 二、目的： 建立神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法和研究酒精損傷神經(jīng)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并探討酒精對神?jīng)前體細(xì)胞的作用及細(xì)胞內(nèi)信號通路，為開展研究孕期酒精對胎兒神經(jīng)干細(xì)胞的損傷及對策提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)

5、： 分析懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球中相鄰細(xì)胞之間的連接方式，為了解神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中連接子的變化規(guī)律提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)： 探討神經(jīng)干分化過程中產(chǎn)生的衍生物對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用，為臨床神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。 三、方法： 本試驗(yàn)以Wistar大鼠13.5-14天胚胎大腦皮層細(xì)胞為試驗(yàn)材料，用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液于37℃、5％CO<,2>、飽和濕度條件下培養(yǎng)細(xì)胞。 1、用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液原代貼壁培養(yǎng)

6、細(xì)胞5天，用nestin熒光抗體對其進(jìn)行鑒定并計(jì)數(shù)確定神經(jīng)干細(xì)胞陽性比率；用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)證明貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力。 2、貼壁培養(yǎng)5天神經(jīng)前體細(xì)胞，進(jìn)行分組試驗(yàn)：在培養(yǎng)液中分別加入終濃度為25mM、50mM、100mM及200mM的酒精，作用24小時，加入PI和Ho.33342熒光探針，標(biāo)記正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞，確定不同濃度的酒精導(dǎo)致的神經(jīng)前體細(xì)胞死亡方式；并根據(jù)不同濃度的酒精對無bFGF和加入bFGF培養(yǎng)條件的

7、細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)分組，分別統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。 3、貼壁培養(yǎng)5天神經(jīng)前體細(xì)胞，加入不同濃度的酒精24小時后，用激光共聚焦顯微鏡Ca離子成像法檢測細(xì)胞內(nèi)Ca離子含量的變化：用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt含量的變化，以確定酒精抑制神經(jīng)前體細(xì)胞增殖作用相關(guān)的細(xì)胞信號通路。 4、用透射電鏡技術(shù)對原代培養(yǎng)5天的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，并用Cx43及Cx32熒光抗體對克隆球中間隙連接蛋白進(jìn)行鑒定，確定細(xì)胞間

8、連接蛋白的成分。 5、以全反式視黃酸誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞克隆球向神經(jīng)元分化，與C6細(xì)胞共培養(yǎng)，并收集神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)上清液加入C6細(xì)胞培養(yǎng)液中，在倒置相差顯微鏡下觀察C6細(xì)胞的增殖狀態(tài)，從形態(tài)學(xué)角度初步探討神經(jīng)干細(xì)胞分化衍塵物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長抑制作用。 四、結(jié)果： 1、經(jīng)免疫熒光技術(shù)鑒定，貼壁培養(yǎng)5天的神經(jīng)前體細(xì)胞，95％以上為nestin及BrdU陽性細(xì)胞，說明在該培養(yǎng)體系中95％以上的細(xì)胞仍處于原始的未分

9、化狀態(tài)，并且具有增殖能力。 2、PI及Ho.33342熒光染色結(jié)果顯示，酒精濃度達(dá)到200mM時，貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞大部分出現(xiàn)壞死，中低濃度酒精則出現(xiàn)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞數(shù)量減少的情況。 3、通過BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞計(jì)數(shù)證實(shí)，(1)酒精能夠抑制bFGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖，并有濃度依賴性；(2)酒精能夠抑制神經(jīng)前體細(xì)胞在沒有bFGF刺激的情況下的自發(fā)增殖。后者的作用可能與凋亡細(xì)胞的增多有關(guān)。 4、用激光共聚焦顯微鏡C

10、a<'2+>成像法半定量檢測細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度和用流式細(xì)胞儀定量檢測細(xì)胞內(nèi)Akt的含量的變化發(fā)現(xiàn)，(1)酒精明顯減少生長因子信號通路的Ca<'2+>濃度；(2)酒精能夠減少bFGF引起的Akt的磷酸化。結(jié)果提示：酒精抑制bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖與RTK下游PLC及P13K兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。 5、用Cx43及Cx32熒光抗體對克隆球中細(xì)胞間隙連接蛋白進(jìn)行鑒定：神經(jīng)干細(xì)胞克隆球細(xì)胞間存在間隙連接，其連接蛋白主要成分為連接蛋白

11、43(connexin43，Cx43)，而連接蛋白Cx32為陰性。對比分化后的神經(jīng)元，Cx43及Cx32均呈陰性。結(jié)果提示間隙連接中的連接蛋白Cx43與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。 6、倒置相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長梭形，生長速度很快。加入含有神經(jīng)干細(xì)胞分化衍生物的培養(yǎng)液及與正在分化的神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)后，C6細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞形態(tài)由細(xì)長梭形變?yōu)楸馄蕉嘟切危?xì)胞數(shù)量下降，生長速度明顯受到抑制。

12、 五、結(jié)論： 通過免疫熒光技術(shù)對貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞鑒定證實(shí)，貼壁培養(yǎng)5天的神經(jīng)細(xì)胞中，95％的細(xì)胞仍具有干細(xì)胞的特征，處于未分化狀態(tài)及保持增殖能力，是用來研究神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化特性及其損傷保護(hù)理想的實(shí)驗(yàn)材料。酒精對神經(jīng)前體細(xì)胞損傷作用主要有兩種機(jī)制：細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期的延長。酒精濃度達(dá)到200mM時，神經(jīng)前體細(xì)胞大部分出現(xiàn)壞死，中低濃度酒精可以誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞細(xì)胞凋亡，從而造成細(xì)胞數(shù)量減少。酒精對bFGF誘導(dǎo)的神經(jīng)前體

13、細(xì)胞增殖和自發(fā)增殖均有抑制作用，并有濃度依賴性。 酒精明顯減少生長因子信號通路的Ca<'2>濃度及減少bFGF引起的Akt的磷酸化提示：酒精抑制bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖與RTK下游PLC及P13K兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。 神經(jīng)干細(xì)胞克隆球細(xì)胞之間存在間隙連接，主要成分為連接蛋白C×43；分化后的神經(jīng)元不表達(dá)連接蛋白Cx43，證實(shí)連接蛋白Cx43在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育分化過程中有重要意義。 神經(jīng)干細(xì)胞在分化過程中產(chǎn)生的