低氧調節(jié)大鼠CRFR1受體細胞內信號通路.pdf

1、背景和目的：
　　 低氧(Hypoxia)是生物體在自然活動中可能受到的主要應激之一，它對包括人類在內的生物的發(fā)育、行為和健康狀況等有著重要影響。它是一種非特異性應激原，它可誘導機體產生應激反應。下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(Hypothalamus-pituitary-adrenalaxis，HPA)是機體重要的體液調節(jié)系統(tǒng)和應激反應系統(tǒng)，對各種應激做出應答反應，以新的穩(wěn)態(tài)調節(jié)，適應變化了的不利環(huán)境。下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激

2、素(Corticotropinreleasingfactor，CRF)肽是HPA軸的腦中樞調節(jié)者，它調節(jié)神經和體液兩大系統(tǒng)。CRF通過與CRFR1(Corticotropin-releasingfactorreceptor1)和CRFR2(Corticotropin-releasingfactorreceptor2)兩個主要的受體結合發(fā)揮作用。CRFR1屬G-蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupledreceptor，GPCRs)家

3、族，在中樞神經系統(tǒng)和外周組織廣泛分布。CRFR1參與低氧應激生理功能調節(jié)，對神經-內分泌-免疫網(wǎng)絡系統(tǒng)中重要低氧靶基因和蛋白起核心主導調節(jié)作用。
　　 β-Arrestin是G蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupledreceptor，GPCRs)信號通路的重要負調節(jié)因子，與G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-coupledreceptorkinases，GRK)聯(lián)合作用，可以使GPCRs對激動劑的敏感性下降，發(fā)生受體的

4、脫敏反應，調節(jié)受體內吞、信號轉導及細胞凋亡等。首先，被激動劑激活的GPCRs與GRK結合發(fā)生磷酸化，促使β-Arrestin從非活化的晶體結構轉變?yōu)閷κ荏w高親和結構，與磷酸化的活化GPCRs結合，形成三聚體，阻止了受體與G蛋白之間的繼續(xù)作用。
　　 本實驗室利用低氣壓艙模擬高原低氧，從整體和細胞水平，系統(tǒng)地研究了高原低氧應激與適應及其作用機理。本實驗目的是研究急性和連續(xù)慢性低氧對大鼠大腦前額葉皮層CRF、CRFR1、CRFR2、

5、GRK3和β-Arrestin1/2基因表達的影響，分析低氧調節(jié)CRFR1受體的細胞內信號通路；利用培養(yǎng)大鼠原代星形膠質細胞，研究神經肽CRF對細胞內β-Arrestin1/2、Gαs、cAMP、PKC等分子表達的調節(jié)。
　　 實驗設計和方法：
　　 利用低氧艙模擬高原低氧的方法，將實驗大鼠暴露于低氧7km(8.0％O2，41.83kPa)8h和24h，5km(10.8％O2，54.02kPa)連續(xù)低氧5d和15d，動物

6、在低氧暴露結束后被犧牲，大腦用于本實驗研究。采用實時定量PCR研究低氧對大鼠大腦前額葉皮層CRF、CRHR1、CRHR2、GRK3和β-Arrestin1/2基因表達的影響。培養(yǎng)大鼠原代星形膠質細胞，研究神經肽CRF對β-Arrestin1/2、Gαs、cAMP、PKC亞型表達的調節(jié)。
　　 實驗結果：
　　 1.急性7km低氧8h可以增加大鼠大腦前額葉皮層CRFmRNA表達，而7km低氧24hCRFmRNA表達和對照組

7、相比沒有顯著性差異；急性7km低氧8h可以增加大鼠大腦前額葉皮層CRFR1mRNA表達，而7km低氧24h，CRFR1mRNA表達明顯減少；7km低氧8h后大鼠大腦前額葉皮層CRFR2mRNA表達明顯減少，而7km低氧24hCRFR2mRNA表達沒有顯著性差異；而5km連續(xù)慢性低氧5d和15d后，CRF、CRFR1和CRFR2mRNA基因表達回復到對照水平，與對照組比較無明顯差異。
　　 2.急性7km低氧8h可以增加大鼠大腦前

8、額葉皮層GRK3mRNA表達，而7km低氧24h，GRK3mRNA表達明顯減少，5km低氧連續(xù)5d明顯降低GRK3mRNA表達，而連續(xù)15d低氧后，GRK3mRNA表達恢復對照水平。
　　 3.7km低氧8h后大鼠大腦前額葉皮層β-Arrestin1mRNA表達明顯減少，7km低氧24h后β-Arrestin1mRNA表達沒有差異；5km連續(xù)低氧5d后，β-Arrestin1mRNA表達沒有差異，而在5km連續(xù)15d低氧后β-A

9、rrestin1mRNA表達明顯升高。7km低氧8h大鼠大腦前額葉皮層β-Arrestin2mRNA表達沒有差異，而在7km低氧24h后β-Arrestin2mRNA表達明顯減少；慢性5km連續(xù)低氧5d和15d對β-Arrestin2mRNA表達沒有影響。
　　 4.在原代星型膠質細胞，CRF孵育30min可以顯著升高細胞Gαs、cAMP表達；CRF孵育8h后PKCε亞型蛋白表達有顯著上升，但PKCβⅡ蛋白表達無變化；同時發(fā)現(xiàn)C

10、RF孵育8h顯著降低了β-Arrestin1mRNA表達，而β-Arrestin2mRNA表達沒有變化。
　　 小結：
　　 急性低氧7km8h上調GRK3、CRF和CRFR1，下調CRFR2受體基因表達，而7km24h嚴重低氧抑制GRK3、CRF、CRFR1和CRFR2受體基因表達，同時也抑制β-Arrestin2mRNA；慢性連續(xù)低氧通過增加β-Arrestin1mRNA下調CRFR1受體基因表達，是CRFR1受體脫

11、敏的機制之一。機體CRF分泌的減少，以及β-Arrestin1mRNA的增加使CRFR1受體脫敏可能是機體對慢性低氧的反應性降低的基礎。
　　 在原代星型膠質細胞，CRF短時通過細胞CRFR1受體活化的Gαs.cAMP的調節(jié)PKA信號通路。而長時調節(jié)PKC信號通路主要是通過PKCε亞型，不是PKCβⅡ。CRF孵育8h后β-Arrestin1mRNA表達下調與整體大鼠急性低氧7km的結果一致，提示嚴重低氧或高水平CRF暴露抑制β-