miR-34c與CRFR1調(diào)節(jié)大鼠青少年早期應(yīng)激經(jīng)歷致創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙易感性.pdf

1、1.前言：
　　創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是一種特殊形式的焦慮障礙，是指?jìng)€(gè)體在經(jīng)歷或目睹異乎尋常的、嚴(yán)重的威脅性或?yàn)?zāi)難性事件后所導(dǎo)致的延遲出現(xiàn)和持續(xù)存在的反應(yīng)。有研究證實(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamus-Pituitary-adrenal，HPA）軸的異常激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂和行為異常。因此，HPA軸的功能紊亂是PTSD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因子之一。多項(xiàng)

2、研究結(jié)果表明，PTSD的發(fā)病涉及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotrophinreleasing factor，CRF)過度分泌或應(yīng)激源誘導(dǎo)的CRH過度反應(yīng)。作為激活和調(diào)節(jié)HPA軸功能的上游關(guān)鍵因子，CRF及其受體CRFR1(corticotrophin releasingfactor receptor1)在焦慮、抑郁和PTSD等情感障礙的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色。
　　眾多研究證實(shí)，個(gè)體對(duì)PTSD的易感性存在差異，而早年

3、應(yīng)激經(jīng)歷是導(dǎo)致PTSD易感性增加的重要因素之一。青少年時(shí)期是個(gè)體神經(jīng)生物和行為發(fā)展的一個(gè)非常關(guān)鍵和特殊的時(shí)期，在這期間我們可以觀察到邊緣系統(tǒng)和前額葉皮質(zhì)區(qū)域的特異性改變。在個(gè)體早年發(fā)育期間對(duì)CRF受體的表達(dá)及其功能進(jìn)行調(diào)節(jié)可能是其相關(guān)神經(jīng)元功能失調(diào)的重要原因，并且該影響可能會(huì)持續(xù)終生，這無疑會(huì)增加成年期罹患應(yīng)激相關(guān)疾病的易感性。另外，表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠暴露于應(yīng)激環(huán)境時(shí)，杏仁核miR-34c表達(dá)水平升高，焦慮樣行為降低，進(jìn)一步研究發(fā)

4、現(xiàn)，miR-34c作用的靶點(diǎn)之一是CRFR1mRNA。但對(duì)早年應(yīng)激經(jīng)歷與CRFR1和miR-34c以及PTSD易感性關(guān)系的研究非常有限。許多研究均證實(shí)，運(yùn)動(dòng)作為一種潛在的非藥物治療手段，對(duì)大腦功能以及神經(jīng)元可塑性都大有裨益。本實(shí)驗(yàn)聚焦青少年期創(chuàng)傷應(yīng)激對(duì)成年動(dòng)物焦慮、抑郁行為、HPA軸功能、中樞CRFR1和miR-34c的影響，揭示CRFR1和miR-34c在早年經(jīng)歷致PTSD發(fā)病易感性中的作用，以及規(guī)律跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)PTSD樣癥狀的調(diào)節(jié)作用

5、。
　　2.目的：
　　(1)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激對(duì)成年期焦慮與抑郁樣行為、記憶、HPA軸功能及CRFR1表達(dá)的作用。
　　(2)規(guī)律跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)與CRFR1拮抗劑對(duì)行為、HPA軸功能及CRFR1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　(3)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激對(duì)行為學(xué)、CRFR1、CRFR1 mRNA和miR-34c表達(dá)的短期和長(zhǎng)期作用;CRFR1拮抗劑對(duì)上述指標(biāo)的改善作用。
　　3.方法：
　　(1)實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)一:6

6、4只雄性21日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(CON)、應(yīng)激組(S)、應(yīng)激加運(yùn)動(dòng)組(S+E)和應(yīng)激加拮抗劑組(S+A)，每組16只。除去對(duì)照組，其它三組均制備PTSD模型。實(shí)驗(yàn)二:72只雄性21日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為三組:對(duì)照組(CON)、應(yīng)激組(S)和應(yīng)激加拮抗劑組(S+A)，每組24只。在PTSD造模完成兩周后，每組隨機(jī)抽取12只進(jìn)行行為學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，其余12只繼續(xù)飼養(yǎng)至成年（造模完成六周后）后進(jìn)行行為學(xué)和分子生

7、物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　(2) PTSD模型制備將大鼠置于密閉不透光的電擊箱中，大鼠足部收到持續(xù)6s，連續(xù)20次不可逃避的電流刺激，電流強(qiáng)度為8mA。電擊時(shí)間間隔隨機(jī)，每次持續(xù)30min。上下午各一次，間隔時(shí)間不少于4h，持續(xù)6天。
　　(3) CRFR1拮抗劑CP-154，526的使用方法S+A組動(dòng)物在PTSD模型建立后第二天腹腔注射CRFR1拮抗劑。將拮抗劑溶于80％的聚乙烯乙二醇400中，劑量為3.2mg/kg/day，持續(xù)1

8、4天。為平衡處理誤差，其它組的動(dòng)物腹腔注射80％的聚乙烯乙二醇400。
　　(4)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練程序?qū)嶒?yàn)一中的S+E組的動(dòng)物在PTSD模型建立后第二天開始為期六周，每周五次的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。
　　(5) DEX/CRH聯(lián)合試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，每組隨機(jī)抽取8只大鼠接受DEX/CRH聯(lián)合試驗(yàn)。
　　(6)行為學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)一在造模完成六周后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，試驗(yàn)二分別在造模完成后兩周和六周進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。行為學(xué)測(cè)試包括曠場(chǎng)試驗(yàn)

9、、高架十字迷宮試驗(yàn)，Y迷宮試驗(yàn)和Morris水迷宮測(cè)試。
　　(7)免疫組化檢測(cè)CRFR1表達(dá)實(shí)驗(yàn)一行為學(xué)測(cè)試結(jié)束以后，隨機(jī)抽取大鼠處死，腦組織分離后用蠟塊包埋。內(nèi)側(cè)前額葉、下丘腦、海馬和杏仁核的組織切片方向?yàn)楣跔?，厚度?微米，隨后采用免疫組化染色方法檢測(cè)CRFR1表達(dá)。
　　(8)免疫印跡分析CRFR1表達(dá)取內(nèi)側(cè)前額葉、下丘腦、海馬和杏仁核組織在冰上勻漿，勻漿液在低溫離心機(jī)中以14000轉(zhuǎn)的速度離心30分鐘，取上清液。測(cè)

10、得蛋白濃度后以一定的比率與上樣緩沖液混合95℃加熱變性。取總量20微克的蛋白于12％的凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。牛奶封閉后，PVDF膜加一抗4℃過夜，第二天PBST漂洗后加二抗室溫孵育一小時(shí)。PBST漂洗后加入ECL發(fā)光液顯影，條帶的灰度值使用Image J14.0軟件計(jì)算。
　　(9)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CRFR1mRNA和miR-34c取50-100mg的下丘腦組織，加入1毫升Trizol提取總RNA。取1mlRNA采用實(shí)時(shí)

11、定量PCR的方法用來檢測(cè)CRFR1 mRNA和miR-34c。其相對(duì)表達(dá)量用以下公式計(jì)算，2^-[(Ct ofCRFR1 mRNA)-(Ct of GAPDH)]以及2^-[(Ct of miR-34c)-(Ct of U6)]。
　　4.結(jié)果：
　　(1)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠成年期出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為、記憶功能損害、HPA軸功能失調(diào)和CRFR1表達(dá)異常。
　　(2)長(zhǎng)期規(guī)律的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和CRFR1拮抗劑CP-1

12、54，526的長(zhǎng)期應(yīng)用可明顯改善大鼠中樞CRFR1的表達(dá)。與CRFR1拮抗劑相比，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)減輕大鼠成年期的焦慮和抑郁樣行為，改善其記憶功能，穩(wěn)定HPA軸功能的效果更好。
　　(3)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激在兩周內(nèi)導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為增加和記憶功能損傷，同時(shí)下丘腦miR-34c表達(dá)上調(diào)，CRFR1表達(dá)降低。
　　(4)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠成年后的焦慮樣行為增加和記憶功能損傷，CRFR1表達(dá)升高，但下丘腦miR-34c表達(dá)與

13、對(duì)照組相比無明顯差異。
　　(5) CRFR1拮抗劑CP-154，526明顯升高青少年期和成年期下丘腦miR-34c表達(dá)水平。
　　5.結(jié)論：
　　(1)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠持續(xù)至成年的情緒、記憶、HPA功能以及中樞CRFR1表達(dá)異常。
　　(2)中樞CRFR1表達(dá)異常和下丘腦miR-34c表達(dá)異常在早年應(yīng)激經(jīng)歷致成年期PTSD發(fā)病易感性中發(fā)揮重要的作用。
　　(3)長(zhǎng)期規(guī)律運(yùn)動(dòng)和CRFR1拮抗劑可