槲皮素調(diào)節(jié)大鼠肝細(xì)胞谷胱甘肽代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、目的：
　　本研究將通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討槲皮素對(duì)谷胱甘肽及與其代謝相關(guān)的四種重要的酶(谷胱甘肽過氧化物酶，GSH-Px、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶，GST、谷胱甘肽還原酶，GR和γ-谷氨?；腚装彼徇B接酶，γ-GCL)的活性以及基因轉(zhuǎn)錄水平的的作用。并應(yīng)用三種代表性MAPKs激酶的抑制劑(SP600125、SB203580、PD98059)探討槲皮素對(duì)MAPKs和Keap1-Nrf2-ARE通路的影響機(jī)制及作用靶點(diǎn)，為認(rèn)識(shí)槲皮素調(diào)節(jié)GSH代謝的

2、作用及其相關(guān)機(jī)制和進(jìn)一步研究槲皮素發(fā)揮抗氧化能力防御自由基對(duì)人體的健康損害作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.用5、10和20、30、40和50μ mol/L槲皮素干預(yù)大鼠肝細(xì)胞24h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。用5、10和20μ mol/L槲皮素干預(yù)大鼠肝細(xì)胞24h后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性，高效液相色譜法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞中還

3、原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，以及試劑盒檢測(cè)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽還原酶(GR)和γ-谷氨酰基半胱氨酸連接酶(γ-GCL)活性。
　　2.使用不同濃度的三種MAPKs抑制劑干預(yù)大鼠肝細(xì)胞，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力變化。
　　3.將大鼠肝細(xì)胞分為Control組、Q組（槲皮素干預(yù)組）、SP組（SP600125干預(yù)組）、SB組（SB203580干預(yù)組）、

4、PD組（PD98059干預(yù)組）、Q+SP組（槲皮素和SP600125干預(yù)組共同干預(yù)組）、Q+SB組（槲皮素和SB203580干預(yù)組共同干預(yù)組）、Q+PD組（槲皮素和PD98059干預(yù)組共同干預(yù)組），使用RT-PCR檢測(cè)各組GSH-Px、GST、GR和γ-GCL基因轉(zhuǎn)錄水平變化，使用Western blot法檢測(cè)P38，p-P38蛋白水平變化，使用Luminex法檢測(cè)JJNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白水平變化，。使用ELLESA

5、試劑盒檢測(cè)Keap1蛋白水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.30μmol/L以上劑量的槲皮素干預(yù)組細(xì)胞活性顯著降低。20μmol/L槲皮素干預(yù)大鼠肝細(xì)胞24h后細(xì)胞GSH含量、GST和γ-GCL活性顯著升高，GSH-Px活性顯著降低。
　　2.10-100μmol/L濃度的SP600125，30μmol/L-100μmol/L濃度的SB203580，50μmol/L-100μmol/L濃度的PD98059對(duì)大鼠肝細(xì)胞活力產(chǎn)

6、生抑制作用。
　　3.Q組與對(duì)照組相比，GSH-Px、GST、GR三種酶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，JNK、ERK和p-ERK水平降低、p-JNK和Keap1水平升高。
　　4.SP組與對(duì)照組相比，γ-GCL轉(zhuǎn)錄水平和JNK水平降低，p-JNK水平升高。Q+SP組較SP組JNK水平降低，γ-GCL轉(zhuǎn)錄水平，p-JNK和Keap1水平升高。
　　5.PD組與對(duì)照組相比，ERK、p-ERK水平降低，GSH-Px、γ-GCL的m