槲皮素調節(jié)大鼠肝細胞谷胱甘肽代謝信號轉導通路的研究.pdf

1、目的：
　　本研究將通過細胞實驗探討槲皮素對谷胱甘肽及與其代謝相關的四種重要的酶(谷胱甘肽過氧化物酶，GSH-Px、谷胱甘肽硫轉移酶，GST、谷胱甘肽還原酶，GR和γ-谷氨?；腚装彼徇B接酶，γ-GCL)的活性以及基因轉錄水平的的作用。并應用三種代表性MAPKs激酶的抑制劑(SP600125、SB203580、PD98059)探討槲皮素對MAPKs和Keap1-Nrf2-ARE通路的影響機制及作用靶點，為認識槲皮素調節(jié)GSH代謝的

2、作用及其相關機制和進一步研究槲皮素發(fā)揮抗氧化能力防御自由基對人體的健康損害作用機制提供科學依據。
　　方法：
　　1.用5、10和20、30、40和50μ mol/L槲皮素干預大鼠肝細胞24h后，采用MTT法檢測細胞活力。用5、10和20μ mol/L槲皮素干預大鼠肝細胞24h后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性，高效液相色譜法檢測大鼠肝細胞中還

3、原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，以及試劑盒檢測谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)、谷胱甘肽還原酶(GR)和γ-谷氨?；腚装彼徇B接酶(γ-GCL)活性。
　　2.使用不同濃度的三種MAPKs抑制劑干預大鼠肝細胞，使用MTT法檢測細胞活力變化。
　　3.將大鼠肝細胞分為Control組、Q組（槲皮素干預組）、SP組（SP600125干預組）、SB組（SB203580干預組）、

4、PD組（PD98059干預組）、Q+SP組（槲皮素和SP600125干預組共同干預組）、Q+SB組（槲皮素和SB203580干預組共同干預組）、Q+PD組（槲皮素和PD98059干預組共同干預組），使用RT-PCR檢測各組GSH-Px、GST、GR和γ-GCL基因轉錄水平變化，使用Western blot法檢測P38，p-P38蛋白水平變化，使用Luminex法檢測JJNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白水平變化，。使用ELLESA

5、試劑盒檢測Keap1蛋白水平變化。
　　結果：
　　1.30μmol/L以上劑量的槲皮素干預組細胞活性顯著降低。20μmol/L槲皮素干預大鼠肝細胞24h后細胞GSH含量、GST和γ-GCL活性顯著升高，GSH-Px活性顯著降低。
　　2.10-100μmol/L濃度的SP600125，30μmol/L-100μmol/L濃度的SB203580，50μmol/L-100μmol/L濃度的PD98059對大鼠肝細胞活力產

6、生抑制作用。
　　3.Q組與對照組相比，GSH-Px、GST、GR三種酶基因的轉錄水平顯著提高，JNK、ERK和p-ERK水平降低、p-JNK和Keap1水平升高。
　　4.SP組與對照組相比，γ-GCL轉錄水平和JNK水平降低，p-JNK水平升高。Q+SP組較SP組JNK水平降低，γ-GCL轉錄水平，p-JNK和Keap1水平升高。
　　5.PD組與對照組相比，ERK、p-ERK水平降低，GSH-Px、γ-GCL的m