脂聯(lián)素在L-02細(xì)胞中對肝糖代謝信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：在人肝細(xì)胞株L-02中獲取具有生物學(xué)活性的脂聯(lián)素重組蛋白的分泌性表達(dá)，并在L-02細(xì)胞中探討脂聯(lián)素抑制糖異生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：①從人脂肪組織中提取總RNA，利用RT-PCR方法得到人脂聯(lián)素基因cDNA序列，自行設(shè)計(jì)引物一對，經(jīng)PCR擴(kuò)增人脂聯(lián)素基因完全編碼序列，構(gòu)建pMD18-T/ADPN重組克隆質(zhì)粒，目的序列測序鑒定；PCR擴(kuò)增脂聯(lián)素目的片段，連至真核表達(dá)載體pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO，構(gòu)建脂聯(lián)

2、素真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO-ADPN。②將pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO-ADPN轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細(xì)胞，篩選可能含有陽性克隆的白色菌落進(jìn)行鑒定，提取陽性克隆中的重組質(zhì)粒，命名為pCDNA3.1-ADPN。③將pCDNA3.1-ADPN經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)、G418篩選后轉(zhuǎn)染至人肝細(xì)胞株L-02，免疫熒光法觀察轉(zhuǎn)染率，收獲的細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE、western blot、細(xì)胞免疫組

3、織化學(xué)法檢測脂聯(lián)素表達(dá)情況。④用含0 mmol/L、5 mmol/L、15 mmol/L和30 mmol/L葡萄糖的培基分別模擬無糖、低糖、中糖、高糖環(huán)境。將轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-ADPN的L-02細(xì)胞和對照組分別在上述環(huán)境中處理24 h，酶學(xué)法測定培養(yǎng)基血糖，觀察重組脂聯(lián)素蛋白的活性。⑤以western blot測定正常L-02組、轉(zhuǎn)染組、30 mmol/L，glucose處理組和“饑餓”組(72 h未換液)中phospho-AMPK

4、、及其下游環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、phospho-CREB蛋白表達(dá)情況，免疫組化法觀察四組細(xì)胞中環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白輔激活物2(TORC2)的定位情況，葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法測定葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)活性。
　　 結(jié)果：①成功構(gòu)建脂聯(lián)素克隆質(zhì)粒pMD18-T/ADPN和真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO-ADPN(簡稱pCDNA3.1-ADPN)。②轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-ADPN的L-02細(xì)

5、胞在免疫熒光顯微鏡下可見綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染率在60％以上。③在細(xì)胞培養(yǎng)上清和沉淀中均檢測到表達(dá)產(chǎn)物，表明重組蛋白利用自身信號肽獲得分泌性表達(dá)。細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)的重組蛋白分子量約為57 kD，具有人脂聯(lián)素抗原性。④轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-ADPN的L-02細(xì)胞高糖(30 mmol/L)處理24 h后其培基血糖低于對照組(p<0.05)，但在無糖、低糖和中糖環(huán)境中無明顯差異(p>0.05)。⑤與其它組比較，轉(zhuǎn)染組：ph

6、ospho-AMPK蛋白表達(dá)升高(p<0.05)，TORC2主要在定位在細(xì)胞質(zhì)中，G6P酶的活性顯著降低(p<0.05)，但CREB、phospho-CREB蛋白表達(dá)無明顯差異(p>0.05)。
　　 結(jié)論：我們成功構(gòu)建了人脂聯(lián)素真核表達(dá)質(zhì)粒，并在人肝細(xì)胞株L-02中得到可溶性、分泌性表達(dá)，獲得的重組蛋白具有生物學(xué)活性。脂聯(lián)素抑制糖異生的機(jī)制可能與活化phospho-AMPK，抑制TORC2進(jìn)入核內(nèi)，從而抑制糖異生酶G6P的表達(dá)