CRFR1介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)前額葉皮層IGFs和IGFBPs表達(dá)的調(diào)節(jié).pdf

1、背景和目的
　　胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factors，IGFs）家族包括IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ，Ⅰ型、Ⅱ型胰島素樣生長因子受體，胰島素受體(IR)以及6個(gè)與IGF高度親和力的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP1-6)，以及最近發(fā)現(xiàn)的IGFBP7，又稱之為IGFBP-rP。還包括一些能夠水解IGFBPs的蛋白酶類。IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ是多肽類的神經(jīng)營養(yǎng)因子，二者具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，能抵抗細(xì)

2、胞凋亡引起的損傷，減輕缺氧缺血對腦組織的損傷。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1-6（Insulin-like growthfactor binding protein1-6，IGFBP1-6）具有高度同源性，與IGF有高度親和力。其N端結(jié)構(gòu)域的保守序列有利于IGF的結(jié)合，C端除了參與IGF的結(jié)合外，還與IGFBPs的獨(dú)立作用有關(guān)。IGFBPs的生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮還受到翻譯后修飾的影響，例如糖基化修飾、磷酸化修飾等。
　　CRF是促腎上腺激

3、素皮質(zhì)釋放激素的簡稱，是由下丘腦產(chǎn)生并分泌的一種重要神經(jīng)肽，最早在羊的下丘腦中分離得到。CRF在調(diào)節(jié)機(jī)體下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）的功能中起重要作用。研究報(bào)道CRF主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中合成，外周的CRF可能是由神經(jīng)細(xì)胞通過軸突運(yùn)輸至末端得到的。
　　本實(shí)驗(yàn)利用低壓低氧艙模擬5km低氧環(huán)境，研究大鼠暴露于急性低氧(8h和24 h)和慢性低氧（5d、10d和

4、15d）后前額葉皮層IGF家族基因表達(dá)變化，目的是探討急性低氧和慢性低氧對IGFs家族基因表達(dá)和蛋白的影響。并利用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(IMR32)和大鼠原代前額葉皮層神經(jīng)元，進(jìn)一步研究低氧激活的CRF對IGFs和IGFBPs基因表達(dá)的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法
　　整體實(shí)驗(yàn):大鼠暴露于低氧艙模擬的低氧，研究急性低氧和慢性連續(xù)低氧對前額葉皮層IGF家族的表達(dá)影響。急性低氧5km(≈10.8％ O2 at sea le

5、vel，54.02kPa)暴露分為8h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn);慢性連續(xù)低氧5km暴露分為5d，10d和15d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)動物分組為:對照組和不同時(shí)間低氧暴露組。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn):利用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（IMR-32）細(xì)胞系和原代大鼠前額葉皮層神經(jīng)元，研究低氧激活的CRF通過與CRFR1結(jié)合，激活PKA信號通路，是否參與調(diào)節(jié)細(xì)胞中IGFs和IGFBPs的基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組為:對照組，CRF組(0.1nM，1nM和10 nM)，CRFR1

6、拮抗劑組和PKA拮抗劑組。利用CRFR1拮抗劑，PKA拮抗劑，研究CRF是否參與急慢性低氧下調(diào)節(jié)IGFs和IGFBPs的基因表達(dá)。
　　采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測IGFs和IGFBPs各成員基因表達(dá)，用ELISA方法檢測血清和組織中的IGF-Ⅰ蛋白水平變化，用Western-blot方法檢測IGFBP1的蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.低氧改變大鼠前額葉皮層IGFⅠ和Ⅱ基因表達(dá)。急性低氧5km8h顯著升高了大鼠前額

7、葉皮層IGF-Ⅰ mRNA的表達(dá)，但24h時(shí)，表達(dá)明顯降低。低氧24h下調(diào)了IGF-Ⅱ mRNA的表達(dá)。慢性低氧5d時(shí)，大鼠前額葉皮層IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ mRNA表達(dá)下降，但10d和15d時(shí)，IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ mRNA的表達(dá)恢復(fù)到正常對照水平。
　　2.低氧上調(diào)大鼠前額葉皮層IGF-1R基因表達(dá)。急性低氧5km8h時(shí)，大鼠前額葉皮層IGF-1R mRNA表達(dá)顯著升高;但低氧24 h時(shí)，IGF-1R mRNA的表達(dá)顯著下降

8、。IGFBP1的基因表達(dá)在5km急性低氧8h時(shí)顯著升高，24h時(shí)顯著降低。慢性低氧5km5d顯著降低了大鼠前額葉皮層IGF-1R mRNA的表達(dá)，10d時(shí)，IGF-1RmRNA的表達(dá)和對照相比無明顯差異，但慢性低氧15d時(shí)其表達(dá)顯著升高。慢性低氧5km5d時(shí)，IGFBP1 mRNA表達(dá)顯著降低，10d和15d時(shí)其表達(dá)均恢復(fù)到對照水平。
　　3.急性低氧和慢性低氧對IGFBP2-6 mRNA的表達(dá)沒有明顯影響。急性低氧8h時(shí)，IGF

9、BP4和IGFBP6都有顯著升高，其他結(jié)合蛋白基因表達(dá)量與對照組相比顯著下降。在急性低氧24 h時(shí)，除了IGFBP5，其他結(jié)合蛋白與對照組相比基因水平都顯著下調(diào)。慢性低氧5d時(shí)，IGFBP2和IGFBP-3的mRNA表達(dá)顯著下降，而IGFBP4，IGFBP5和IGFBP6的基因表達(dá)與對照組相比均無顯著性差異。慢性低氧15d時(shí)，IGFBP3的基因表達(dá)顯著上升，IGFBP2，-4，-5，-6的基因表達(dá)與對照組相比無顯著性差異。
　　4

10、.低氧上調(diào)前額葉皮層和血清IGF-Ⅰ水平。慢性低氧5d時(shí)，血清IGF-Ⅰ水平顯著升高。急性低氧8h前額葉皮層IGF-Ⅰ蛋白表達(dá)量顯著升高。
　　5.低氧上調(diào)前額葉皮層IGFBP1的蛋白表達(dá)。急性低氧8h，24 h和5d時(shí)，前額葉皮層IGFBP1的蛋白表達(dá)均明顯升高。
　　6.1 nM CRF可以增加原代培養(yǎng)的前額葉皮層神經(jīng)元cAMP水平，CRFR1拮抗劑可以阻斷CRF誘導(dǎo)的cAMP的增加。
　　7.CRF顯著升高IMR

11、32細(xì)胞系IGF-Ⅰ和IGF-1R的mRNA表達(dá)，CRFR1拮抗劑可以阻斷IGF-1R的mRNA的表達(dá)。
　　小結(jié)
　　急性和慢性連續(xù)低氧對大鼠前額葉皮層中IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ，IGF-1R和IGFBP1-6mRNA的表達(dá)表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)模式。急性低氧IGF-Ⅰ和IGFBP1 mRNA表達(dá)顯著升高。而在慢性連續(xù)低氧IGF-Ⅰ和IGFBP1 mRNA表達(dá)回復(fù)到對照水平，但I(xiàn)GF-1R的表達(dá)仍然保持較高水平。急性和慢性低氧升高