大鼠肝癌發(fā)生過程中PI3K-AKT信號通路在卵圓細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下三個部分展開論述：
　　第一部分:
　　目的：建立大鼠卵圓細(xì)胞增殖模型,并優(yōu)化對卵圓細(xì)胞分離、鑒定的實(shí)驗(yàn)方法。
　　方法：采用15mg/kg灌胃劑量的2-AAF/PH模型誘導(dǎo)大鼠卵圓細(xì)胞增殖,術(shù)后采用改良的膠原酶灌注消化、密度梯度離心法分離卵圓細(xì)胞,用免疫組化,RT-PCR,電鏡,細(xì)胞免疫熒光的方法鑒定卵圓細(xì)胞。并用OV-6免疫組化結(jié)果觀察卵圓細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果：15mg/kg劑量的2-AA

2、F/PH模型可以穩(wěn)定地誘導(dǎo)大鼠卵圓細(xì)胞增殖。細(xì)胞免疫組化,RT-PCR,細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示有OV-6,AFP,CK-19,ALB,C-Kit的相對特異性的表達(dá)。電鏡下觀察卵圓細(xì)胞符合幼稚細(xì)胞的特點(diǎn)。卵圓細(xì)胞的增殖峰在術(shù)后8-11天出現(xiàn)。
　　結(jié)論：15mg/kg劑量的2-AAF/PH模型可以穩(wěn)定地誘導(dǎo)大鼠卵圓細(xì)胞增殖,在術(shù)后8-11天時(shí)分離可最大限度地獲取卵圓細(xì)胞。
　　第二部分:
　　目的：探討PI3K/AKT信號

3、通路主要基因在2-AAF/PH模型卵圓細(xì)胞增殖中的表達(dá)和意義。
　　方法：利用第一部分所建立的2-AAF/PH模型,使用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blotting對術(shù)后不同時(shí)期所分離的卵圓細(xì)胞內(nèi)PTEN、AKT、NF-κB的mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測,使用Hoechst33342檢測卵圓細(xì)胞凋亡情況。使用免疫組化的方法檢測肝臟組織內(nèi) TGF-α的表達(dá),并分析其相關(guān)性和意義。單獨(dú)或聯(lián)合使用 PI3K特異性抑制劑 LY29400

4、2及特異性抑制劑PDTC體外作用于卵圓細(xì)胞系LE6,使用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blotting對其PTEN、pAKT、NF-κB的mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：pAKT、NF-κB的mRNA和蛋白水平從術(shù)后第8天起顯著下降,PTEN則逐漸升高(P<0.05)。卵圓細(xì)胞凋亡在PH后第8天起逐漸增高(P<0.05)。TGF-α在術(shù)后第6天達(dá)到高峰。單獨(dú)使用LY294002和聯(lián)合 PDTC使用時(shí)可使 LE6細(xì)胞內(nèi) p

5、Akt, NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)較未作用前明顯下降;而單獨(dú)使用PDTC作用于LE6細(xì)胞后,僅觀察到NF-κB表達(dá)下降,pAkt mRNA、蛋白水平無明顯改變。
　　結(jié)論：PI3K/AKT信號通路中PTEN可通過抑制pAKT而下調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。TGF-α在肝臟微環(huán)境中可能刺激PI3K/AKT信號通路調(diào)控卵圓細(xì)胞的增殖。深入研究PI3K/AKT信號通路可能為卵圓細(xì)胞的增殖、分化和肝癌發(fā)生的研究提供理論基礎(chǔ)。
　

6、　第三部分：
　　目的：研究 PI3K/AKT信號通路主要基因在大鼠肝癌發(fā)生過程中卵圓細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與肝癌發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：采用3’-甲基-4-二甲基氨基偶氮苯(3’-Me-DAB)誘癌,使用實(shí)時(shí)定量 PCR和Western Blotting的方法對誘癌不同階段的大鼠卵圓細(xì)胞中的 PTEN、pAKT、NF-κB和AFP mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：PTEN mRNA和蛋白水平在肝癌發(fā)生過程中,在卵圓細(xì)胞內(nèi)