PI3K-AKT信號通路在小鼠MC3T3-E1細胞分化—鈣化過程中相關(guān)作用的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:研究PI3K/AKT信號通路在破骨細胞骨吸收上清(bone resorptionsupernatant，BRS)促成骨樣細胞MC3T3-E1細胞分化-鈣化過程中的作用;以及AKT2節(jié)點蛋白與MC3T3-E1細胞分行鈣化過程的關(guān)系。方法:采用前期實驗收集的破骨細胞骨吸收上清(BRS)處理小鼠MC3T3-E1細胞，并加入不同濃度的特異性阻斷劑LY294002(5μM，10μM，20μM)，蛋白免疫印跡實驗(western-boltti

2、ng)檢測相關(guān)信號蛋白AKT, p-AKT的表達;酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測骨鈣素(osteocalcin，OCN)表達水平;茜素紅染色檢測細胞外基質(zhì)鈣化水平。采用RNA干擾(RNA inference，RNAi)方法沉默MC3T3-E1細胞中AKT2基因，繼而檢測骨鈣素表達及鈣化水平改變。
　　 結(jié)果:破骨細胞骨吸收上清BRS作用后MC3T3-E1細胞P

3、I3K/AKT信號通路下游分子AKT及p-AKT表達顯著增加(P＜0.05)。特異性抑制劑LY294002阻斷后，P-AKT出現(xiàn)了劑量依賴性降低(P＜0.05)，AKT蛋白表達水平無明顯差異。該結(jié)果證實LY294002成功阻斷了PI3K/AKT信號通路。相應(yīng)的骨鈣素ELISA結(jié)果及茜素紅染色結(jié)果顯示LY294002阻斷該信號通路后，骨鈣素的表達和鈣化結(jié)節(jié)的形成面積均被抑制，且為劑量依賴性降低(P＜0.05)。慢病毒干擾后，熒光顯微鏡觀察

4、及real-time PCR結(jié)果說明，細胞內(nèi)AKT2基因被成功抑制;該基因被抑制后細胞骨鈣素的分泌及鈣化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生受到了明顯的降低。
　　 結(jié)論:阻斷劑LY294002能有效的阻斷MC3T3-E1細胞的PI3K/AKT信號通路;PI3K/AKT信號通路在BRS促小鼠MC3T3-E1細胞分化-鈣化過程中發(fā)揮重要的作用;應(yīng)用pKLO.1-TRC-AKT2轉(zhuǎn)染小鼠MC3T3-E1細胞能顯著沉默AKT2表達。AKT2與MC3T3-E1細

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