人牙周成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成結(jié)合上皮樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:
　　 口腔結(jié)合上皮(junctional epithelium,JE)是附著在牙頸部連接結(jié)締組織與牙面的特殊上皮結(jié)構(gòu),形成齦-牙結(jié)合部。結(jié)合上皮來(lái)自于縮余釉上皮,是一種無(wú)角化無(wú)釘突的上皮組織,也是口腔生理上的一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)。在牙周炎發(fā)生時(shí),結(jié)合上皮首先被破壞,是牙周炎的始發(fā)部位。由于結(jié)合上皮的摧毀,導(dǎo)致牙周袋形成和牙槽骨吸收,牙周炎進(jìn)入進(jìn)展期和活動(dòng)期,成為嚴(yán)重破壞口腔咀嚼功能的疾病。當(dāng)牙周炎靜止后,結(jié)合上皮所構(gòu)成的齦-牙結(jié)

2、合修復(fù)緩慢,正常牙周結(jié)構(gòu)重建困難。因此,研究結(jié)合上皮的再生和誘導(dǎo)是研究牙周炎治療后牙周功能結(jié)構(gòu)重建的難點(diǎn)和重點(diǎn)。本研究擬通過(guò)對(duì)人牙周成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng),誘導(dǎo)形成結(jié)合上皮樣細(xì)胞,生長(zhǎng)在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)支架和小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)支架組織上,探討誘導(dǎo)形成的結(jié)合上皮樣細(xì)胞及其形成的組織結(jié)構(gòu),為齦-牙結(jié)合部的形成提供上皮細(xì)胞來(lái)源的理論

3、依據(jù)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。
　　 牙周膜又稱牙周韌帶(Periodontal ligament),是牙根與牙槽骨之間的一層結(jié)締組織,是重要的牙周支持組織,主要由成纖維細(xì)胞組成。許多研究已證明牙周成纖維細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性[1～4]。正常情況下,牙周組織具有極強(qiáng)的修復(fù)能力,其修復(fù)活動(dòng)是通過(guò)牙周膜中的不同細(xì)胞亞群的定向遷移和分化實(shí)現(xiàn)的[5、6]。本實(shí)驗(yàn)擬采用牙周成纖維細(xì)胞,誘導(dǎo)成為上皮樣細(xì)胞,揭示牙周成纖維細(xì)胞具備多向分化的干細(xì)胞特征。

4、r>　　 隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展,選擇適合的支架材料是組織工程研究的又一重要內(nèi)容。目前,常用的支架材料有豬小腸粘膜下層支架、引導(dǎo)組織再生膠原膜、脫細(xì)胞真皮基質(zhì),納米羥基磷灰石等。這些材料多具有良好的生物相容性、多孔性結(jié)構(gòu)和高孔隙率及生物可降解性[7]。本實(shí)驗(yàn)選用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)和小腸黏膜下層(smallintestinal submucosa,SIS)兩種支架材料作為結(jié)合上皮樣細(xì)

5、胞附著的支架組織,探討結(jié)合上皮樣細(xì)胞對(duì)支架組織的附著能力及相容性,并探討結(jié)合上皮樣細(xì)胞在支架組織上生長(zhǎng)的免疫特性和超微結(jié)構(gòu)。
　　 方法:
　　 1人牙周成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定收集河北醫(yī)大口腔醫(yī)院正畸拔除的健康完整雙尖牙(患者12～30歲),刮下其根中1/3牙周膜組織。采用組織塊培養(yǎng)法,培養(yǎng)液選用含20％胎牛血清的低糖DMEM,0.25％胰酶消化,傳代至第3代,采用抗波形蛋白vimentin和抗細(xì)胞角蛋白CK的免疫細(xì)胞化

6、學(xué)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 2人牙周成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)采用K-SFM培養(yǎng)液,對(duì)第3代人牙周成細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)7～10天,采用抗波形蛋白vimentin和抗細(xì)胞角蛋白CK的免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 3小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)支架組織的制備
　　 留取豬空腸組織50 cm,去除其漿膜層和肌層,在含有雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS溶液中浸泡3 h;0.25％胰酶

7、中浸泡24 h;雙蒸水漂洗,0.5％SDS24 h;雙蒸水漂洗。在含0.1％過(guò)氧乙酸的20％乙醇溶液中浸泡10 h,雙蒸水漂洗;凍干后環(huán)氧乙烷消毒備用。
　　 4人牙周成纖維細(xì)胞接種及誘導(dǎo)培養(yǎng)將人牙周成纖維細(xì)胞分別接種到小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)和脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)上,K-SFM誘導(dǎo)培養(yǎng)3～5天。石蠟包埋,組織切片角蛋白CK免

8、疫組織化學(xué)染色。掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　 結(jié)果:
　　 1原代培養(yǎng)及其鑒定牙周組織原代培養(yǎng)7～10天,細(xì)胞爬出,獲得的成纖維細(xì)胞呈梭形、胞體大,核大,圓形或橢圓形,有1～3個(gè)核仁。采用第3代細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定,成纖維細(xì)胞對(duì)抗波形蛋白vimentin呈陽(yáng)性反應(yīng),抗角蛋白CK陰性反應(yīng)。
　　 2人牙周成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定經(jīng)K-SFM誘導(dǎo)后細(xì)胞爬片,免疫細(xì)胞化學(xué)染色,抗角蛋白CK陽(yáng)性表達(dá),表

9、明牙周成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后,具備上皮細(xì)胞的免疫特性。
　　 3小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)支架組織的電鏡觀察制備所得SIS經(jīng)掃描電鏡觀察為無(wú)細(xì)胞的膠原束。
　　 4人牙周成纖維細(xì)胞接種及誘導(dǎo)培養(yǎng)牙周成纖維細(xì)胞在支架組織上誘導(dǎo)培養(yǎng)后,石蠟包埋切片,免疫組織化學(xué)染色,抗角蛋白CK陽(yáng)性表達(dá)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)良好,成片生長(zhǎng),細(xì)胞多邊形,扁平樣,核圓形或橢圓,核仁1