OECs較星型膠質(zhì)細(xì)胞對NSCs分化作用的比較研究.pdf

1、目的:
　　建立體外純化培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞(Olfactory ensheathing cells, OECs)的穩(wěn)定方法并觀察培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征;比較大鼠嗅鞘細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞在體外對神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)分化的影響。
　　方法:
　　分別從新生SD大鼠的嗅球采用小劑量阿糖胞苷分次純化法分離、培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞;從海馬、大腦皮質(zhì)分離、培養(yǎng)星型膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞,觀察細(xì)胞的形態(tài)發(fā)育特點及

2、免疫組化特性。收集嗅鞘細(xì)胞及其上清液、星型膠質(zhì)細(xì)胞及其上清液,將實驗分為5組:組Ⅰ:OECs上清液+NSCs;組Ⅱ: OECs+NSCs;組Ⅲ:星型膠質(zhì)細(xì)胞上清液+ NSCs;組Ⅳ:星型膠質(zhì)細(xì)胞+ NSCs;組Ⅴ:NSCs單獨培養(yǎng)作為對照;將NSCs克隆球平均分成5份,加入各組,不加b-FGF、EFGF、B27,組Ⅰ和組Ⅲ分別用培養(yǎng)了OECs、星形膠質(zhì)細(xì)胞24h的DMEM/F12(1:1)上清液3ml培養(yǎng),每24h換液,組Ⅱ和組Ⅳ、組Ⅴ

3、用 DMEM/F12(1:1)3ml培養(yǎng),每24h換液,各組置于相同條件培養(yǎng)箱培養(yǎng),倒置顯微鏡下動態(tài)觀察各組NSCs被誘導(dǎo)分化的細(xì)胞的生長情況,并采用免疫組化法對分化細(xì)胞鑒定和計數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1、原代培養(yǎng)后24小時OECs形態(tài)基本可辨,背景可見成纖維細(xì)胞,第2天開始予小劑量阿糖胞苷分次純化后成纖維細(xì)胞大大減少,OECs的外形主要以突起細(xì)長的雙極和三極為主,或無突起呈“煎蛋樣”,隨時間延長細(xì)胞生長排列呈現(xiàn)一定方向性;細(xì)

4、胞免疫化學(xué)示大部分細(xì)胞神經(jīng)生長因子受體 P75(neurotrophin receptor p75,NGFRp75)陽性表達(dá)。
　　2、比較大鼠嗅鞘細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞在體外對 NSCs分化的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn):組Ⅰ、組Ⅱ的NSCs球6h已開始貼壁生長,至第7天,多數(shù)分化為具有2-3個長突起,胞體圓形或橢圓形的神經(jīng)元樣細(xì)胞, NF200(1:150)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示這類細(xì)胞胞體甚至突觸皆被染成棕黃色,胞核不染色,為強陽性,證明該類細(xì)胞

5、為神經(jīng)元,計算其神經(jīng)元分化率:組Ⅰ為(51.43±8.58)％,組Ⅱ為(50.11±9.56)%;組Ⅲ、組Ⅳ大部分細(xì)胞 NF200(1:150)染色陰性,GFAP(1:150)陽性,其神經(jīng)元分化率分別為(17.25±3.01)%、(15.51±1.62)%;組Ⅴ的NSCs球大多數(shù)在3-4天后萎縮、漂浮,5-7天基本死亡,神經(jīng)元分化率為(0.56±0.33)%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析嗅鞘細(xì)胞組的神經(jīng)元分化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于星型膠質(zhì)細(xì)胞組及對照組的神經(jīng)元分化