核受體相關(guān)因子1基因轉(zhuǎn)染骨髓源性神經(jīng)干細胞體外誘導(dǎo)向多巴胺能神經(jīng)元分化的實驗研究.pdf

1、目的:
　　觀察核受體相關(guān)因子1(Nurr1)基因轉(zhuǎn)染骨髓源性神經(jīng)干細胞在體外誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的作用，擬探討提高神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的比例。
　　方法:
　　1.通過全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，流式細胞術(shù)檢測細胞免疫表型。
　　2.取P4～6生長良好的骨髓間充質(zhì)干細胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)液改為無血清神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基(DMEM/F12+20μg/L bFGF+20μg/L EG

2、F+2％B27)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細胞向神經(jīng)干細胞分化，采用免疫熒光法和流式細胞術(shù)鑒定。
　　3.采用脂質(zhì)體法將pcDNA3.1-hygro-Nurr1轉(zhuǎn)染骨髓源性神經(jīng)干細胞，RT-PCR觀察Nurr1基因的表達情況，并進行G418篩選。
　　4.將骨髓源性神經(jīng)干細胞分為4組進行分化實驗:其中將未轉(zhuǎn)染的骨髓源性神經(jīng)干細胞隨機分為對照組，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組;將篩選出的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽性的神經(jīng)干細胞分為核受體相關(guān)因子1組和核受體相

3、關(guān)因子1+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組，分化培養(yǎng)后，免疫熒光法和RT-PCR檢測酪氨酸羥化酶的表達量。
　　結(jié)果:
　　1.通過貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，5代后細胞呈均一梭形漩渦樣生長，高表達CD90及CD29，幾乎不表達CD45及CD34。
　　2.在無血清培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出的骨髓源性神經(jīng)干細胞均表達Nestin抗原，流式細胞儀檢測P4神經(jīng)干細胞，Nestin陽性率達到(96.7±2.1)％。
　　3.RT

4、-PCR顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的骨髓源性神經(jīng)干細胞4d后核受體相關(guān)因子1高表達，分化結(jié)果顯示:核受體相關(guān)因子1+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組細胞內(nèi)酪氨酸羥化酶在mRNA水平上的表達量最高，神經(jīng)干細胞貼壁分化后各組的酪氨酸羥化酶陽性細胞比例均明顯高于對照組，其中以核受體相關(guān)因子1+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組分化比例最高，為(52.44±15.9)％。
　　結(jié)論:
　　1.利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法可迅速高效地分離和純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，并在無血清神