杜仲葉蛋白的分離純化及藥理活性研究.pdf

1、杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)為國(guó)內(nèi)特有的藥用物種，是一種經(jīng)常作為臨床使用的藥品。因?yàn)橐恢倍际鞘褂闷と胨?，使用成本較大，且藥材較少，所以人們逐漸用杜仲的葉取代皮入藥。據(jù)研究表明，杜仲葉主要有肝腎虧損、腰膝酸軟、疼痛、安胎等作用。但是所有的研究主要集中在杜仲葉的小分子化合物上，對(duì)于杜仲葉的大分子蛋白研究較少。
　　本實(shí)驗(yàn)是從杜仲葉中分離純化出多種生物活性蛋白，為杜仲葉在保健或醫(yī)療行業(yè)的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。本實(shí)

2、驗(yàn)以杜仲葉為研究材料，通過(guò)粉碎，閃式提取、鹽析、水提醇沉淀法、水提酮沉淀法等得出最優(yōu)提取水溶性蛋白的方法，并通過(guò)透析、葡聚糖凝膠柱層析、凝膠電泳等方法從杜仲葉中提取出具有生物活性的蛋白組分。通過(guò)蛋白質(zhì)含量測(cè)定以及抗菌、抗氧化等方面的分析，得到結(jié)果如下：
　　1、以牛血清蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，用Bradford法，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程是y=3.8375x+0.0005，相關(guān)系數(shù)是0.9995。
　　2、以杜仲葉蛋白的

3、清蛋白提取量為指標(biāo)，分別進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合工業(yè)效益，得出最優(yōu)的工藝條件是料液比1:20，閃提次數(shù)10，浸取時(shí)間60min，于4℃提取，以轉(zhuǎn)速5000rpm，離心15min，將所得上清液合并。
　　3、分別使用硫酸銨、乙醇、丙酮對(duì)提取的蛋白溶液進(jìn)行提取，并稱重，分別為0.0451g、0.1076g、0.1940g，得出了硫酸銨鹽析的方法是實(shí)驗(yàn)室條件下簡(jiǎn)單高效的提取方法。
　　4、分別使用終濃度30％、45%、6

4、0%、75%、90%硫酸銨對(duì)杜仲葉提取水溶性粗蛋白，得出粗蛋白重量、蛋白濃度值及得率。粗蛋白重量分別為0.1928g、0.159g、0.1301g、0.2238g、0.2025g，蛋白濃度分別為0.1495μg/μl、0.12581μg/μl、0.11481μg/μl、0.10975μg/μl、0.12099μg/μl，得率分別為372.5μg/g、314.519μg/g、287.013μg/g、274.375μg/g、302.463μ

5、g/g，因此優(yōu)選30%終濃度的硫酸銨可以有效的對(duì)杜仲葉水溶性蛋白進(jìn)行粗分離。
　　5、使用聚丙烯凝膠電泳方法，探究了不同濃度硫酸銨對(duì)杜仲葉蛋白提取組分的影響，得出了使用終濃度為30%的硫酸銨提取蛋白組分較多。
　　6、使用透析、過(guò)濾、葡聚糖凝膠層析等方法，得出了2種不同分子量的蛋白。
　　7、通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除的實(shí)驗(yàn)，證明了5種粗蛋白濃度處于0.0-1.0mg/mL時(shí)，均能產(chǎn)生不同程度的清除作用，而且隨著劑量的變

6、大，清除能力也在不斷的變大；其中終濃度30%、90%硫酸銨析出的粗蛋白在濃度為1.0mg/L時(shí)，清除率較大，分別為39.4%、41.7%。且終濃度30%硫酸銨鹽析并經(jīng)過(guò)純化后的兩個(gè)不同蛋白均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。
　　8、通過(guò)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性實(shí)驗(yàn)，證明了使用終濃度30%、45%、60%、75%、90%硫酸銨得到的杜仲葉粗蛋白，在濃度1.5×104mg/L時(shí)，不產(chǎn)生對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性。