寬體金線蛭提取物初步分離純化及其抗氧化活性研究.pdf

1、水蛭作為一味傳統(tǒng)的藥材有廣泛的醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用，以往對(duì)水蛭的研究主要集中在其抗凝血活性、抗血栓等活性上，而很少見(jiàn)對(duì)水蛭抗氧化活性的研究。本論文采取硫酸銨分段鹽析與CMSepharose FF陽(yáng)離子交換層析等方法對(duì)寬體金線蛭蛋白及短肽提取物進(jìn)行初步分離純化，并以清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基活性為指標(biāo)，研究寬體金線蛭蛋白及短肽提取物的抗氧化活性。主要研究結(jié)果如下。
　　1.比較寬體金線蛭鮮品與凍干品的抗氧化活性
　

2、　采用濃度為0.9％的生理鹽水提取寬體金線蛭鮮品與凍干品粗蛋白，分別測(cè)定其清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基活性。結(jié)果顯示，凍干品三種清除自由基活性均強(qiáng)于鮮品，并且凍干品與鮮品清除羥基自由基、ABTS自由基的活性均好于抗壞血酸陽(yáng)性對(duì)照組，但其清除超氧陰離子自由基活性較抗壞血酸差。
　　2.寬體金線蛭蛋白提取物抗氧化活性
　　采用生理鹽水提取寬體金線蛭蛋白，分別用硫酸銨分段鹽析、CMSepharose FF陽(yáng)離子

3、交換層析對(duì)水蛭粗蛋白進(jìn)行初步分離純化，并篩選活性較強(qiáng)的部分(硫酸銨分段鹽選擇0-30%、70%-100%部分，CMSepharose FF陽(yáng)離子交換層析選擇3、4號(hào)峰)，測(cè)定各活性部分的三種清除自由基活性。結(jié)果顯示，分段鹽析后0-30%部分清除羥基自由基活性強(qiáng)于抗壞血酸，但清除超氧陰離子自由基、ABTS自由基活性不及抗壞血酸，70%-100%部分三種清除自由基活性均不及抗壞血酸。而經(jīng)CMSepharose FF分離后，3、4號(hào)峰清除三種

4、自由基活性均明顯高于抗壞血酸，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。
　　3.寬體金線蛭酶解液抗氧化活性
　　采用三水平四因素正交試驗(yàn)，用木瓜蛋白酶酶解寬體金線蛭，以肽含量為指標(biāo)，確定最佳酶解工藝即加酶量7500U/g，酶解溫度40℃，料液比1:4(W/V),酶解時(shí)間4h，最初pH8.5。CMSepharose FF陽(yáng)離子交換層析對(duì)寬體金線蛭短肽進(jìn)行初步分離純化，并測(cè)定其原液及分離純化后活性較強(qiáng)部分(2、3號(hào)峰)的三種清除自由基活性。結(jié)果

5、顯示，酶解原液三種清除自由基活性均弱于抗壞血酸，但經(jīng)CMSepharose FF分離后，各組分清除羥基自由基、ABTS自由基活性均明顯強(qiáng)于抗壞血酸，但其清除超氧陰離子自由基活性弱于抗壞血酸。經(jīng)Sephadex G-25對(duì)CMSepharose FF組分脫鹽后，用Q-TOF測(cè)定活性強(qiáng)的組分的分子量分布主要集中在130.96Da~330.34Da范圍內(nèi)。
　　4.寬體金線蛭蛋白及多肽提取物均有較好的抗氧化活性，并且經(jīng)CMSepharo

6、se FF分離純化后期抗氧化活性均明顯提高，較抗壞血酸對(duì)照組強(qiáng)；水蛭肽的活性較水蛭蛋白稍弱。
　　在采用硫酸銨初步分離水蛭蛋白時(shí)，A(0-30%)顯示出較好的清除羥基自由基及清除ABTS+自由基能力，A、C(70%-100%)的抗氧化能力都較B(30%-70%)強(qiáng)，與之前研究水蛭抗凝血活性時(shí)，往往選用B段進(jìn)行研究有所不同；另外，與以往文獻(xiàn)報(bào)道的采用Q-sepha rose FF、DEAE等陰離子交換層析分離水蛭抗凝血成分不同，本文