鋅指蛋白zbtb20對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控作用.pdf

1、本課題研究了鋅指蛋白zbtb20對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控作用。主要構(gòu)建了zbtb20真核表達(dá)載體并建立了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的zbtb20干擾模型和小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的zbtb20穩(wěn)定表達(dá)模型，發(fā)現(xiàn)干擾zbtb20的表達(dá)可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素，并抑制ERK,JNK,P38的活化；以zbtb20基因缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞為模型進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果。相反，過表達(dá)zbtb20具有促進(jìn)效應(yīng)。因此，zb

2、tb20是TLR4信號(hào)通路的正向調(diào)控分子。
　　 鋅指蛋白zbtb20對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控作用
　　 Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類重要的模式識(shí)別受體(PRRs)，因其與果蠅中的Toll基因相似而得名[1,2,3,4]，其通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)而啟動(dòng)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[5]

3、。目前至少已經(jīng)報(bào)道了11種人TLRs和13種小鼠TLRs[6,7]。TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的人TLR[8],LPS與其結(jié)合可以啟動(dòng)MyD88(Myeloid different factory88)依賴的和TRIF(TIR domaincontaining adaptor inducing interferon-β)依賴的信號(hào)通路，介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和干擾素的產(chǎn)生，以清除外來病原體。但TLRs的過度活化會(huì)導(dǎo)致自身免疫病、內(nèi)毒素休克等免疫病理狀

4、態(tài)，所以TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中存在著精細(xì)的調(diào)控機(jī)制以保持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。
　　 鋅指蛋白zbtb20(zinc finger and BTB domain containing20)是由本研究團(tuán)隊(duì)最早從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中克隆出的一個(gè)新的全長cDNA并于2001年率先報(bào)道[9]，因其是樹突細(xì)胞來源的BTB/POZ鋅指蛋白，所以當(dāng)時(shí)稱之為DPZF(BTB/POZzincfinger protein deriving from hum

5、an dendritic cells)。早期研究發(fā)現(xiàn)其在造血系統(tǒng)特別是免疫細(xì)胞中能夠比較優(yōu)勢(shì)表達(dá)。近年來對(duì)其所作的研究主要集中于神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟[10,11,12,13]，對(duì)于其在免疫系統(tǒng)中的功能和作用機(jī)制至今還沒有報(bào)道。本課題對(duì)zbtb20在TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。
　　 一、小鼠zbtb20的克隆和表達(dá)
　　 我們使用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的cDNA克隆了zbtb20的全長核苷酸序列

6、，并以此序列為模板構(gòu)建了zbtb20真核表達(dá)載體。同時(shí)我們用LPS(100ng/ml)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞觀察在不同的時(shí)間點(diǎn)zbtb20表達(dá)量的變化。定量PCR的結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長，zbtb20的表達(dá)量下降，這種誘導(dǎo)性的表達(dá)變化提示我們zbtb20有可能在TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。
　　 二、過表達(dá)zbtb20對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控
　　 我們將構(gòu)建的zbtb20真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞系RAW264

7、.7，采用新霉素篩選的方法，得到了zbtb20的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，稱之為RAW-zbtb20。采用RT-PCR和Westonblotting的方法證實(shí)了RAW-zbtb20細(xì)胞的過表達(dá)zbtb20效果。同時(shí)我們利用此細(xì)胞株為模型觀察了zbtb20對(duì)LPS觸發(fā)的TLR4信號(hào)通路的調(diào)控作用。首先我們用LPS(100ng/ml)刺激RAW-zbtb20，觀察前炎性細(xì)胞因子和IFN-β的變化，RT-PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了zbtb20過表達(dá)可

8、以顯著提高細(xì)胞因子的分泌。同時(shí)我們也觀察了過表達(dá)zbtb20對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞絲裂原活化的蛋白激酶通路(包括ERK、JNK、P38)的影響，結(jié)果顯示，過表達(dá)zbtb20可以明顯提高LPS觸發(fā)的ERK、JNK、P38的活化。
　　 三、干擾zbtb20表達(dá)和zbtb20缺陷對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控
　　 我們用RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)了zbtb20的siRAN，并將siRAN轉(zhuǎn)入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，定量PCR證明其干擾

9、效率可以達(dá)到80％；用LPS刺激此細(xì)胞，用定量PCR和ELISA檢測(cè)了細(xì)胞因子的變化，結(jié)果與過表達(dá)zbtb20相反，即干擾zbtb20可以抑制LPS觸發(fā)的巨噬細(xì)胞分泌前炎性細(xì)胞因子和IFN-β。以zbtb20基因缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞為模型進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果。
　　 綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，鋅指蛋白zbtb20參與了巨噬細(xì)胞TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并發(fā)揮正向調(diào)控的作用，其能夠促進(jìn)TLR4觸發(fā)的前炎性細(xì)胞因子和IFeN-β的產(chǎn)生。