五個棉花逆境相關(guān)鋅指蛋白基因的功能初步分析.pdf

1、棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，是紡織工業(yè)最重要的天然原料。陸地棉是棉花最主要的栽培種，其產(chǎn)量占全球棉花總產(chǎn)量的90％以上。但是由于棉花的種植地區(qū)大都位于干旱和半干旱的地區(qū)，各種自然災(zāi)害，比如干旱、鹽堿、低溫、枯黃萎病都嚴(yán)重制約著棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的提高。培育高抗的棉花品種是棉花育種的主要任務(wù)之一。
　　 鋅指蛋白是一類與鋅離子結(jié)合并折疊成手指狀結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的總稱，是轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多的成員。鋅指結(jié)構(gòu)域主要依靠半胱氨酸和組氨酸來結(jié)合鋅離子

2、，其排列順序決定了鋅指蛋白結(jié)合鋅離子的方式。鋅指結(jié)構(gòu)域功能多樣，可以結(jié)合DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，含有鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)參與生物體生命活動的各個環(huán)節(jié)。在植物中，有些鋅指蛋白，包括一些植物特有的鋅指蛋白，參與植物對生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。
　　 我實驗室前期從棉花中克隆到5個鋅指類蛋白基因，分別為GhSAP1，GhBBX1，GhRCHY1，GhZFP2和GhZFP3。利用實時熒光定量PCR方法檢測供試的5個鋅指類基因在受到

3、非生物脅迫表達(dá)情況。結(jié)果表明:與對照相比，這5個GhZFPs類基因均極顯著受干旱、NaCl和ABA誘導(dǎo)表達(dá)。本研究以這5個鋅指類基因為研究對象，構(gòu)建植物表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入煙草中，探討它們在轉(zhuǎn)基因煙草中受干旱、鹽脅迫的表現(xiàn)，進(jìn)而明確其功能。結(jié)果如下:
　　 1、利用pBI121載體，構(gòu)建了35S啟動子分別啟動5個基因的植物表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入煙草，分別得到每個基因10個克隆的T0代植株。通過不同濃度的Kan+篩選相應(yīng)轉(zhuǎn)基因煙草的T1

4、代種子，獲得最佳Kan+抗性篩選濃度150mg/ml。進(jìn)一步篩選獲得抗性的T1代植株。每一轉(zhuǎn)基因材料分別選取3個克隆系9個單株的T1代植株葉片提取DNA和RNA，通過PCR和RT-PCR檢測驗證獲得的T1代陽性植株的外源目標(biāo)基因正常插入與表達(dá)。收到的T2代陽性自交種子，結(jié)合PCR驗證獲得所需的T2代純系植株。
　　 2、選擇每個轉(zhuǎn)基因載體各3個克隆純系的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行鹽脅迫處理，檢測葉綠素含量，類胡蘿卜素含量，SOD活性，MDA

5、含量，蔗糖和總糖含量，K+/Na+等7個抗鹽相關(guān)指標(biāo)。通過對轉(zhuǎn)基因材料的不同濃度鹽脅迫處理，確定最佳NaCl鹽脅迫處理濃度為200mM?；谠摑舛忍幚聿煌D(zhuǎn)基因煙草材料，抗鹽相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果表明:GhSAP1、GhZFP2、GhZFP3、 GhBBX1、GhRCHY1這五個基因的轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下:所有轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量極顯著高于野生型;轉(zhuǎn)GhBBX1植株的類胡蘿卜素含量極顯著高于野生型，轉(zhuǎn)GhSAP1、GhZFP2和GhRCHY

6、1的類胡蘿卜素顯著高于野生型，同時轉(zhuǎn)GhBBX1植株的類胡蘿卜素含量顯著高于轉(zhuǎn)GhSAP1、GhZFP2、GhZFP3植株的含量;所有轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性極顯著地高于野生型，同時轉(zhuǎn)GhBBX1植株的活性極顯著地高于其他轉(zhuǎn)基因植株;所有轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量極顯著低于野生型，同時轉(zhuǎn)GhBBX1和GhSAP1的MDA含量極顯著低于其他轉(zhuǎn)基因植株;所有轉(zhuǎn)基因植株的蔗糖和總糖含量都極顯著地高于野生型，轉(zhuǎn)GhBBX1的蔗糖含量極顯著地高于其他轉(zhuǎn)

7、基因植株，總糖含量顯著性高于其他轉(zhuǎn)基因植株;所有轉(zhuǎn)基因植株地上部分的K+/Na+極顯著地高于野生型，轉(zhuǎn)GhBBX1和GhZFP2地下部分K+/Na+極顯著地高于野生型。結(jié)果表明:在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株光合作用色素合成能力比野生型強(qiáng);滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累也比野生型多;清除活性氧的酶活比野生型高，同時質(zhì)膜氧化產(chǎn)物比野生型低;能更好地將外界的Na+、K+從根部運輸?shù)饺~片，保持營養(yǎng)平衡。
　　 研究表明這五個基因的轉(zhuǎn)基因煙草其耐鹽性依次是:

8、GhBBX1、GhSAP1、GhRCHY1、GhZFP2和GhZFP3。
　　 3、選擇每個轉(zhuǎn)基因載體各3個克隆純系的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行干旱脅迫處理，檢測葉綠素含量，類胡蘿卜素含量，SOD活性，MDA含量，蔗糖和總糖含量等6個抗旱相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明:GhSAP1、GhZFP2、GhZFP3、GhBBX1、GhRCHY1這五個基因的轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下:轉(zhuǎn)GhSAP1、GhZFP2、GhZFP3、GhRCHY1植株的葉綠素含量極顯著

9、高于野生型;轉(zhuǎn)GhZFP2、GhZFP3植株的類胡蘿卜素顯著性高于野生型;所有轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性極顯著地高于野生型，同時轉(zhuǎn)GhZFP2、GhZFP3植株的SOD活性極顯著地高于其他轉(zhuǎn)基因植株;所有轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量極顯著低于野生型，同時轉(zhuǎn)GhZFP2、GhZFP3植株的MDA含量極顯著低于其他轉(zhuǎn)基因植株;所有轉(zhuǎn)基因植株的蔗糖和可溶性總糖含量極顯著高于野生型，轉(zhuǎn)GhZFP2、GhZFP3植株的含量極顯著高于其他轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明