七個(gè)鷹嘴豆逆境相關(guān)基因(CarNAC1~6和CarPRP1)的克隆及功能初步分析.pdf

1、生物和非生物脅迫嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。NAC基因在植物發(fā)育和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)以及逆境應(yīng)答分子網(wǎng)絡(luò)中扮演著極其重要的角色,是作物抗逆遺傳工程的優(yōu)良候選資源。目前關(guān)于NAC基因的研究主要集中于擬南芥扣水稻等少數(shù)模式作物。鑒于同源基因在不同物種間可能存在功能差異,廣泛地從不同植物中分離和研究NAC基因是有必要的。鷹嘴豆是世界第三大豆類作物,它生育期短,抗逆性強(qiáng),基因組小,用于挖掘抗逆關(guān)鍵基因和解析植物生長(zhǎng)發(fā)育及耐逆分子機(jī)制擁有巨大的潛力。然而,

2、目前該作物在分子生物學(xué)方面的研究較為缺乏,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。為了構(gòu)筑鷹嘴豆分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)并挖掘逆境脅迫相關(guān)基因,本實(shí)驗(yàn)室于2007年利用新疆抗逆種質(zhì)構(gòu)建了干旱脅迫相關(guān)的cDNA文庫(kù)。在該cDNA文庫(kù)中,我們發(fā)現(xiàn)6條獨(dú)立的NAC樣基因片段、1個(gè)GPRP基因ORF以及1條ACTIN基因片段。鑒于NAC及GPRP基因可能具有重要的生理功能且在鷹嘴豆中還沒(méi)有被克隆,我們分離和鑒定了這6個(gè)NAC和1個(gè)GPRP基因,并廣泛地進(jìn)行發(fā)育及脅迫相關(guān)的表

3、達(dá)分析,還通過(guò)轉(zhuǎn)基因研究初步分析了其中3個(gè)NAC基因的功能。此外,考慮到在鷹嘴豆中至今沒(méi)有可用于表達(dá)分析的內(nèi)標(biāo)基因,我們還克隆了1個(gè)ACTIN基因,并初步調(diào)查了其作為內(nèi)標(biāo)基因使用的可行性。本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　 借助cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE),CARNAC1～6(Cicer arietinum NAC gene)基因被克隆,相應(yīng)cDNA長(zhǎng)度分別為753bp、706bp、927bp、1108bp、987bp和9

4、21bp,依次編碼6個(gè)長(zhǎng)度為239、191、285、339、291和307aa的蛋白質(zhì)。CARNAC1～6基因的基因組序列均含有兩個(gè)長(zhǎng)度不一但位置保守的內(nèi)含子。多重序列比對(duì)分析揭示,CARNAC1～6蛋白N端形成保守的NAC結(jié)構(gòu)域,但C端序列的變異性較大。DNA gelblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CARNAC1～6在基因組中均以單或低拷貝的形式存在。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)6個(gè)CarNAC:GFP融合蛋白均位于洋蔥表皮細(xì)胞核中。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

5、示CARNAC1～6蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能位于C端。以上發(fā)現(xiàn)說(shuō)明,CARNAC1～6屬于典型的NAC基因,其編碼產(chǎn)物在鷹嘴豆體內(nèi)可能也具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　 利用半定量RT-PCR技術(shù),CARNAC1～6基因在多個(gè)發(fā)育過(guò)程中、多種脅迫及激素處理下的表達(dá)模式被調(diào)查分析。除了CarNAC3和CarNAC4基因,其他基因均表現(xiàn)出不同的組織特異性表達(dá)規(guī)律。CarNAC1,3基因的表達(dá)受到衰老的強(qiáng)烈誘導(dǎo),而CarNAC6基因的表達(dá)受到衰老的

6、顯著抑制。在不同發(fā)育階段的籽粒以及逐漸萌發(fā)的種子胚中,6個(gè)CarNAC基因都展現(xiàn)出特定的表達(dá)規(guī)律,具有協(xié)同表達(dá)的特征,表明CARNAC1～6基因在生理功能上既存在差異又相互補(bǔ)充。在葉片中,CARNAC1～6基因都受到干旱的誘導(dǎo)表達(dá),只是響應(yīng)的時(shí)間和強(qiáng)度存在一定的差異。CarNAC1,4,5,6基因的表達(dá)受到鹽脅迫的顯著增強(qiáng)。高溫(37℃)促使CarNAC4,5基因的轉(zhuǎn)錄水平快速增高。CarNAC1,4,6基因的表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)受到低溫(

7、4℃)的誘導(dǎo)。葉片的機(jī)械損傷引起CarNAC1,5基因表達(dá)水平的顯著上升。外源激素處理的結(jié)果顯示,受到脫落酸(ABA)上調(diào)表達(dá)的NAC基因有4個(gè)(CarNAC2,3,4,6),茉莉酸甲酯(MeJA)有1個(gè)(CarNAC4),乙烯利(ET)有4個(gè)(CarNAC1,3,4,6),水楊酸(SA)有4個(gè)(CarNAC1,3,4,5),生長(zhǎng)素(IAA)有5個(gè)(CarNAC1,3-6),赤霉素(GA3)有3個(gè)(CarNAC1,4,6),H2O2有4

8、個(gè)(CarNAC1,3,4,6)。此外還發(fā)現(xiàn),CarNAC3,6基因的轉(zhuǎn)錄受到6-芐基腺嘌呤(6-BA)的顯著抑制。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CarNAC轉(zhuǎn)錄因子既涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)又參與多種環(huán)境脅迫的響應(yīng)。
　　 CarNAC2基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致擬南芥種子萌芽延遲、發(fā)芽勢(shì)低,幼苗莖短小、主根顯著增長(zhǎng),成年植株地上部體型矮小、抽苔開(kāi)花早,結(jié)莢量小。CarNAC2的高同源基因擬南芥XND1由于特異性地抑制木質(zhì)部纖維細(xì)胞次生壁的合成,也導(dǎo)

9、致轉(zhuǎn)基因植株株型矮小,表明二者的功能可能存在共性。
　　 半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CarNAC3與其他NAP亞家族成員(擬南芥NAP、野生小麥NAM-B1和大豆GmNAC1)一樣,在葉片中受到衰老的誘導(dǎo)表達(dá),然而與它們不同的是,過(guò)量表達(dá)CarNAC3基因的擬南芥植株生長(zhǎng)發(fā)育正常,沒(méi)有出現(xiàn)衰老加劇的現(xiàn)象,說(shuō)明它與其他NAP亞家族成員在涉及衰老生理的功能上存在差異。CarNAC3的表達(dá)還受到干旱和ABA的顯著上調(diào),其轉(zhuǎn)基因植

10、株展現(xiàn)了較強(qiáng)的抗旱性并對(duì)ABA高度敏感,說(shuō)明該基因是ABA依賴型干旱應(yīng)答因子。CarNAC3基因的異位表達(dá)沒(méi)有影響擬南芥植株的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程但提高了它的耐旱能力,在作物抗旱基因工程方面展現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力。
　　 CarNAC6基因在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)未影響植株的表型和發(fā)育進(jìn)程,但在苗期顯著增強(qiáng)其耐滲透脅迫的能力。此外,過(guò)量表達(dá)CarNAC6基因的轉(zhuǎn)基因植株展現(xiàn)出較野生型植株更高的ABA敏感性,說(shuō)明該基因?yàn)锳BA依賴型脅迫應(yīng)答因子

11、。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株,六個(gè)與逆境生理密切相關(guān)的擬南芥基因中,有4個(gè)(COR15A,RD22,RD29A,KIN1)的表達(dá)被顯著上調(diào),說(shuō)明CarNAC6的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)了這些基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗?jié)B透脅迫能力。像CarNAC3基因一樣,CarNAC6基因在作物抗逆基因工程上也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 CarPRP1(Cicer arietinum L.glycine—and proline-rich protein)基因包

12、含兩個(gè)內(nèi)含子,編碼一個(gè)長(zhǎng)為186aa的XYPPX家族多肽,在基因組中存在3-4個(gè)拷貝。CarPRP1:GFP融合蛋白被定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中。CarPRP1基因廣泛地表達(dá)在幼苗的根、莖、葉以及花、發(fā)育中的種子和莢中,只是在種子和莢中的表達(dá)量相對(duì)較高。該基因的表達(dá)不受葉片衰老過(guò)程的明顯影響,但在籽粒發(fā)育和種子萌芽過(guò)程中出現(xiàn)規(guī)律性變化。隨著籽粒的逐漸膨大,CarPRP1基因的轉(zhuǎn)錄逐漸被增強(qiáng)。而隨著種子胚芽的逐漸伸長(zhǎng),胚中CarPRP1基因的

13、表達(dá)量逐漸降低。此外,CarPRP1基因的表達(dá)還受到干旱、低溫、高鹽以及機(jī)械損傷等脅迫和ABA、IAA、GA3以及H2O2等化學(xué)處理的誘導(dǎo)。CarPRP1基因在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)能顯著增強(qiáng)植株抗鹽和冷凍脅迫的能力。在非處理情況下,6個(gè)抗逆相關(guān)基因(COR15A,COR47,ERD10,RD22,RD29A,KIN1)在轉(zhuǎn)基因和野生型植株中的表達(dá)沒(méi)有明顯差異,但經(jīng)干旱處理啊3小時(shí)后,所有這些基因在轉(zhuǎn)基因植株中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于野生型植株,

14、這至少是CarPRP1基因能增強(qiáng)植株抗逆性的部分分子機(jī)理。CarPRP1基因在作物抗逆基因工程上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 借助RACE技術(shù),第一個(gè)鷹嘴豆ACTIN基因(CarACT1:Cicer arietinum L.actingene)被克隆。CarACT1基因的cDNA全長(zhǎng)1418bp,編碼一個(gè)長(zhǎng)377aa的蛋白,其基因組序列含有4個(gè)長(zhǎng)度不一的內(nèi)含子。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示ACTIN基因核苷酸序列在整個(gè)生物界都是高度保守的。半