鷹嘴豆NAC轉(zhuǎn)錄因子CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2參與逆境脅迫響應(yīng)的功能分析.pdf

1、干旱、鹽堿等逆境脅迫嚴(yán)重影響了我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。鷹嘴豆作為世界第三大豆類作物，主要生長在干旱、半干旱地區(qū)的，抗逆性強(qiáng)，已進(jìn)化出一套高效的抗逆機(jī)制。因此，鷹嘴豆適合用于挖掘抗逆關(guān)鍵基因和解析植物抗逆分子機(jī)制。本實驗室于2007年利用新疆抗逆鷹嘴豆種質(zhì)構(gòu)建了干旱脅迫相關(guān)的cDNA文庫，并根據(jù)該cDNA文庫信息，克隆了6個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為CarNA C1～6。這6個基因都具有NAC家族的典型結(jié)構(gòu)，并且都能不同程度的響應(yīng)逆境脅迫和激素信

2、號的誘導(dǎo)。越來越多的研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育和生長調(diào)節(jié)以及逆境應(yīng)答分子網(wǎng)絡(luò)中扮演著極其重要的角色，是作物抗逆遺傳工程的優(yōu)良候選資源。因此，我們挑選其中的CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2三個基因，詳細(xì)研究了他們響應(yīng)逆境脅迫和激素信號的表達(dá)情況，分析了啟動子序列的結(jié)構(gòu)以及他們與DNA元件的結(jié)合情況，并通過轉(zhuǎn)基因擬南芥對他們的功能進(jìn)行了研究。本研究的主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過對CarNAC4、CarNAC5和

3、CarNAC2三個基因逆境脅迫和激素處理后的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn):CarNAC4基因在干旱、高鹽、高溫和低溫處理后表達(dá)量明顯上升，在ABA、IAA、MeJA和H2O2處理之后表達(dá)量也明顯上升;CarNAC5基因的表達(dá)量在干旱和高溫誘導(dǎo)后明顯上升，同時還會受到IAA的誘導(dǎo);CarNAC2基因的表達(dá)則僅能受到干旱脅迫和外源ABA的誘導(dǎo)。3個鷹嘴豆NAC家族在響應(yīng)逆境脅迫和激素信號功能上既表現(xiàn)出協(xié)同性又各自具有不同的響應(yīng)模式。
　　

4、2.采用Genome Walking技術(shù)分別克隆CarNAC4和CarNAC5基因上游的啟動子片段，經(jīng)過PLACE等在線軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn):CarNAC4啟動子中包含NAC、MYB、MYC、W盒、DRE、LTRE、PRE等多種逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，還包含ABRE等多種響應(yīng)激素信號的順式作用元件;CarNAC5啟動子中同樣既包含NAC、MYB、MYC、W盒等逆境響應(yīng)元件，也包括ABRE、GARE、EEC等激素響應(yīng)元件。兩個啟動子中這些

5、響應(yīng)逆境和激素信號的元件在數(shù)量和分布上都有較大差異，表明了CarNAC4和CarNAC5基因能夠以不同的模式來響應(yīng)逆境脅迫和激素信號。
　　3.通過非放射性EMSA實驗證實，經(jīng)原核表達(dá)的CarNAC4和CaNAC5蛋白能夠在體外與包含NACRS核心序列的探針特異性結(jié)合;采用酵母單雜交技術(shù)也證實了CarNAC4和CarNAC5蛋白能夠在真核生物酵母體內(nèi)和NAC蛋白的核心結(jié)合序列CGT[A/G]特異性的結(jié)合。為進(jìn)一步研究鷹嘴豆CarN

6、AC4和CarNAC5蛋白對下游基因的調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　4.在擬南芥中過量表達(dá)CarNA C4基因后，分別從表型、生理和分子水平分析轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CarNAC4基因的過表達(dá)擬南芥種子在干旱和鹽脅迫條件下具有更高的發(fā)芽速率，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗經(jīng)過干旱脅迫和鹽脅迫后展現(xiàn)了更高的存活率，并且轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中脯氨酸的含量明顯高于野生型擬南芥，而受脅迫產(chǎn)生的丙二醛含量低于野生型，轉(zhuǎn)基因擬南芥離體葉片展

7、現(xiàn)了較低的失水速率。另外，干旱脅迫下，6個逆境相關(guān)基因（RD29A，ERD10，COR15A，COR47, KIN1，DREB2A）的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥內(nèi)明顯高于野生型擬南芥。CarNAC4基因的過量表達(dá)沒有明顯改變擬南芥植株的生長發(fā)育過程但提高了它的抗旱和耐鹽能力，在作物逆境基因工程方面展現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力。
　　5.在擬南芥中過量表達(dá)CarNAC5基因后，同樣從表型、生理和分子水平分析了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CarN

8、AC5基因的過表達(dá)擬南芥種子在干旱脅迫條件下具有更高的發(fā)芽速率，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗經(jīng)過干旱脅迫后展現(xiàn)了更高的存活率，并且轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中脯氨酸的含量明顯高于野生型擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥離體葉片展現(xiàn)了較低的失水速率。另外，干旱脅迫下，5個逆境相關(guān)基因（RD22，RD29A，ERD10，COR15A，DREB2A）的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥內(nèi)明顯高于野生型擬南芥。同CarNA C4基因一樣，CarNAC5基因在作物抗逆基因工程

9、上也具有潛在的應(yīng)用價值。
　　6.在擬南芥中過量表達(dá)CarNAC2基因后，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)延遲，發(fā)芽速率減慢，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因幼苗下胚軸變短，成年植株開花延遲。經(jīng)過干旱脅迫后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的存活率更高，葉片中能夠積累更多的脯氨酸。離體狀態(tài)下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片水分散失速率更慢。另外，干旱脅迫后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中4個逆境相關(guān)基因（COR15A，RD22，RD29A，KIN1）mRNA水平明顯高于野生型植株。以上結(jié)果表明