番茄NAC1轉(zhuǎn)錄因子的功能分析.pdf

1、肉質(zhì)果實(shí)成熟是一個(gè)精細(xì)的遺傳調(diào)控過程，涉及植物激素、生長調(diào)節(jié)因子和多種生物與非生物環(huán)境因子的相互影響。番茄是生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的模式植物，尤其是在成熟通路方面，包括乙烯、類胡蘿卜素、細(xì)胞壁代謝以及上游信號(hào)和轉(zhuǎn)錄因子的研究。盡管為了揭示果實(shí)成熟的機(jī)理前人做了很多努力，但是啟動(dòng)果實(shí)成熟過程的遺傳組分的核心尚未確定。
　　 NAC(NAM, ATAF1/2，CUC2)轉(zhuǎn)錄因子是近十年來新發(fā)現(xiàn)的具有多種生物功能的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，也是

2、植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。該轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物的生長和發(fā)育過程中起著重要的作用，通過不同的時(shí)、空表達(dá)調(diào)節(jié)著胚胎的發(fā)育，頂端分生組織的形成，側(cè)根的發(fā)育，次生細(xì)胞壁的形成，植物的衰老和果實(shí)的成熟等。除此之外，NAC轉(zhuǎn)錄因子還參與激素信號(hào)的調(diào)控以及植物對生物和非生物逆境反應(yīng)等。
　　 本研究從番茄葉片中克隆到一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAC1，發(fā)現(xiàn)其通過調(diào)節(jié)乙烯和ABA的合成在果實(shí)成熟過程中起調(diào)節(jié)作用，并且過表達(dá)該基因提高了番茄植

3、株的耐冷性。因此，開展SlNAC1的功能研究不僅對揭示番茄果實(shí)成熟的分子機(jī)理，而且對闡明NAC參與的植物低溫響應(yīng)機(jī)制同樣具有十分重要的科學(xué)意義。本研究主要結(jié)果如下:
　　 (1)通過NCBI查得該基因的全長mRNA序列，設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR的方法獲得該基因的全長cDNA。SlNAC1全長954bp，開放閱讀框906bp，編碼302個(gè)氨基酸，分子量約34.8KDa，N端具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。qRT-P

4、CR結(jié)果說明，SlNAC1在花和果實(shí)中表達(dá)量較高，并且隨果實(shí)成熟表達(dá)量增加，同時(shí)該基因的轉(zhuǎn)錄物受低溫，高溫，鹽，干旱，機(jī)械損傷、氧化脅迫以及多種激素誘導(dǎo)。
　　 (2)將SlNAC1：GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，利用激光共聚焦顯微鏡觀察到該融合蛋白定位于細(xì)胞核中。
　　 (3)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-SlNAC1，用IPTG誘導(dǎo)其在大腸桿菌BL21中表達(dá)，將誘導(dǎo)的蛋白純化后免疫小鼠，制備抗體，測得效價(jià)為1∶

5、100，000。Western雜交表明NAC1在蛋白水平受到低溫、高溫、干旱和高鹽的誘導(dǎo)。過表達(dá)株系中NAC1蛋白的表達(dá)量增加，而反義株系中該蛋白的表達(dá)受到抑制。
　　 (4)將SlNAC1的編碼區(qū)與pBI121載體重組，成功構(gòu)建了過表達(dá)載體和反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，通過PCR、qRT-PCR以及western雜交檢測具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明獲得了過表達(dá)SlNAC1和反義抑制SlNAC1表達(dá)的轉(zhuǎn)基

6、因植株。與野生型相比，過表達(dá)株系的成熟果實(shí)為黃色或橙黃色，心皮數(shù)目減少，果皮變薄，種子變大變多;相反，反義株系成熟果實(shí)為深紅色，心皮數(shù)和種子數(shù)減少，果皮變厚，種子變小。HPLC分析表明過表達(dá)株系果實(shí)中番茄紅素減少，葉黃素和β-胡蘿卜相對含量增加;反義果實(shí)番茄紅素增加。氣相色譜分析表明過表達(dá)株系果實(shí)乙烯含量明顯低于野生型，但果實(shí)軟化較早;反義果實(shí)乙烯釋放延遲并且呼吸峰較野生型變小，果實(shí)軟化延遲。
　　 (5) qRT-PCR結(jié)果顯

7、示，與野生型相比，過表達(dá)株系果實(shí)中番茄紅素合成相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，而番茄紅素分解生成下游葉黃素和β-胡蘿卜的基因上調(diào);乙烯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因下調(diào);與細(xì)胞壁代謝相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。而反義株系果實(shí)中上述基因的表達(dá)情況與過表達(dá)株系相反?；蛐酒慕Y(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。酵母單雜交分析表明SlNAC1直接調(diào)控ACS2、ACS4、ACO1和PSY1的表達(dá)。
　　 (6)與野生型相比，過表達(dá)株系果實(shí)中ABA含量增加，而反義株系果

8、實(shí)中ABA含量減少。與同一時(shí)期未處理的果實(shí)相比，用NDGA處理過表達(dá)株系MG時(shí)期的果實(shí)后，果實(shí)的硬度增加，果實(shí)成熟延遲，用ABA處理反義株系MG時(shí)期的果實(shí)后，果實(shí)硬度降低，并且果實(shí)成熟提前。qRT-PCR分析表明，ABA合成的關(guān)鍵基因NCED1和NCED2在過表達(dá)株系中上調(diào)，而在反義株系中這兩個(gè)基因下調(diào)。
　　 (7)低溫弱光（4℃，100μmol m-2 s-1）處理后，野生型和過表達(dá)株系中的H2O2和O2·-含量及相對電導(dǎo)率