高粱轉錄因子SbDREB2基因的克隆與功能分析.pdf

1、干旱、鹽堿、低溫等非生物逆境脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育，極端惡劣條件下甚至導致植株死亡，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物減產(chǎn)的重要因素。高等植物在長期進化過程中為了抵抗這些逆境形成了許多復雜的防御機制。其中DREB類轉錄因子是一類植物中所特有的，能與DRE順式作用元件特異性結合的轉錄因子。該類轉錄因子在非生物逆境脅迫中能激活下游一系列抗逆功能基因的表達，并能提高脯氨酸和蔗糖含量。因此作物遺傳育種中利用DREB轉錄因子來改良作物的抗逆性，能獲得較為理想的

2、綜合效果。
　　 本研究以鹽處理的高粱幼苗為試驗材料，通過電子克隆和RT-PCR技術，克隆高粱DREB轉錄因子基因cDNA序列;利用實時熒光定量PCR技術對基因在不同逆境脅迫下表達模式進行了研究;對基因進行原核表達功能驗證;并構建了植物表達載體轉化煙草。研究結果如下:
　　 1、根據(jù)GenBank電子拼接所得序列設計引物OF和OR，進行RT-PCR擴增，得到cDNA序列1152bp，ORF長789bp，編碼蛋白含262個

3、氨基酸;利用上述引物擴增基因組DNA，得到1個1892bp片段，測序分析表明該基因包含一個740bp的內(nèi)含子，將此基因命名為SbDREB2。預測蛋白分子量為28.64kD，等電點為5.52。氨基酸序列分析表明，該蛋白在82～145區(qū)含有DREB類轉錄因子家族特有的AP2保守結構域，與玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白同源性分別為84％和69％。
　　 2、實時熒光定量PCR分析表明，該基因為組成型表達，在根、莖、葉中均存在表達

4、，根中表達量約是莖中2.5倍，受干旱、高鹽和外源ABA誘導強烈表達，但對低溫幾乎沒有響應。
　　 3、設計含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點的特異性引物DF和DR，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切含有SbDREB2基因的T載體質粒和pET28a原核表達載體質粒，成功構建重組子pET28a-SbDREB2，經(jīng)IPTG誘導獲得32.5kD左右的融合蛋白，與預期理論值相符。
　　 4、設計含有BglⅡ和NcoⅠ酶切位點的特異性引物PF