水稻NAP轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫調(diào)控中的功能分析.pdf

1、水稻是重要的糧食作物，為世界數(shù)目眾多的人口提供膳食營(yíng)養(yǎng)，但是外界環(huán)境和植物作物自身的遺傳特性嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。而非生物逆境包括干旱、鹽堿、低溫等是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子，也是影響作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素，因而研究植物對(duì)非生物逆境的適應(yīng)機(jī)制一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。植物在對(duì)不同逆境反應(yīng)的過(guò)程中涉及非常復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)和大量相應(yīng)基因的表達(dá)，已經(jīng)有很多基因被證實(shí)參與了逆境響應(yīng)通路，但這都離不開(kāi)一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子的參與。
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2、AC轉(zhuǎn)錄因子是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的具有多種生物功能的植物特異轉(zhuǎn)錄因子，受多種生物脅迫和非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境響應(yīng)中起到重要作用。水稻基因組中有117個(gè)NAC家族成員，其中有很多已經(jīng)被證明參與了水稻的逆境響應(yīng)通路。
　　 本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析從水稻（Oryza sativaL.）的基因組中克隆到一個(gè)與擬南芥衰老相關(guān)的基因AtNAP(Atlg69490)的同源基因OsNAP(Os03g0327800)，為進(jìn)一步

3、研究OsNAP的功能，構(gòu)建pCAMBIA1304-35S:OsNAP載體和pCAMBIA1304-35 S:OsNAP-SRDX表達(dá)載體。獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合體株系，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的非生物脅迫抗性進(jìn)行生物學(xué)分析。
　　 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果如下:
　　 1.NAC轉(zhuǎn)錄因子OsNAP的克隆，通過(guò)NCBI(美國(guó)國(guó)立生物信息中心)網(wǎng)站，利用同源克隆方法和RT-PCR技術(shù)，獲取水稻OsNAP轉(zhuǎn)錄因子cDNA全長(zhǎng)，OsNAP的ORF為1

4、179bp，推測(cè)其編碼蛋白含有392個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.55，分子量為42.195KDa。
　　 2.構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體，將OsNAP基因序列插入植物表達(dá)載體pCAMBIA1304中構(gòu)建成帶有綠色熒光蛋白(GFP)的融合蛋白表達(dá)載體。進(jìn)行共聚焦分析，確中構(gòu)建成帶有綠色熒光蛋白(GFP)的融合蛋白表達(dá)載體。進(jìn)行共聚焦分析，確定OsNAP基因在細(xì)胞內(nèi)主要定位于細(xì)胞核中。
　　 3.表達(dá)譜分析:利用Real-time PCR

5、方法分析OsNAP基因在不同激素(6-BA，GA，ABA等)處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況，OsNAP受ABA強(qiáng)烈誘導(dǎo)，6-BA，GA并不能誘導(dǎo)OsNAP基因表達(dá);非生物脅迫（低溫，H2O2，PEG，NaCl等）處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況，OsNAP基因受NaCl，PEG和H2O2顯著誘導(dǎo)表達(dá)，在低溫處理下，OsNAP基因輕微誘導(dǎo)表達(dá);OsNAP基因的器官表達(dá)譜，OsNAP基因主要在葉片中大量表達(dá)，尤其在老葉中表達(dá)量最高，而在芽，莖和花中表達(dá)量較低，在

6、芽中的表達(dá)量最低。
　　 4.OsNAP的功能確定:構(gòu)建35S:目的基因轉(zhuǎn)化日本晴和35S:OsNAP-SRDX轉(zhuǎn)化日本晴，獲得T3純合體過(guò)表達(dá)4個(gè)株系(OX1，OX10，OX11，OX17)，SRDX3個(gè)純合體高表達(dá)株系(SR4，SR6，SR7)。轉(zhuǎn)基因株系在不同的非生物脅迫（鹽，干旱，低溫等非生物脅迫等）的表型及生理生化的分析結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)目標(biāo)基因可以提高宿主對(duì)非生物脅迫的耐性。
　　 5.非生物脅迫相關(guān)基因的分子