西瓜非生物脅迫響應(yīng)R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子基因鑒定.pdf

1、MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與了細(xì)胞分化、激素和環(huán)境因子應(yīng)答等生物過(guò)程，并對(duì)次生代謝、花色素形成過(guò)程以及葉片等器官形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用。西瓜是重要的蔬菜作物，西瓜基因組測(cè)序的完成為揭示MYB家族轉(zhuǎn)錄因子在西瓜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本文以西瓜基因組測(cè)序材料97103(C.lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakaivar.lanatus）為試驗(yàn)材料，通過(guò)生物信息學(xué)的方法，在全

2、基因組水平上對(duì)西瓜R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族進(jìn)行了鑒定和分類;分析了其基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特征、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、染色體定位;利用RT-PCR技術(shù)研究R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子家族在非生物脅迫下的基因表達(dá)，包括低溫、干旱、鹽和ABA;克隆了MYB轉(zhuǎn)錄因子基因ClMYB55，與植物表達(dá)載體PBI121構(gòu)建超量表達(dá)載體。同時(shí)以本實(shí)驗(yàn)室保存的野生西瓜W001為試驗(yàn)材料，對(duì)西瓜再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、利

3、用隱馬爾科夫模型、西瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，在全基因組上鑒定出西瓜MYB家族基因234個(gè)，其中R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因79個(gè)。西瓜79個(gè)R2R3MYB基因不均勻的分布在西瓜11條染色體上，其中第2、3、6、10條染色體上分布較多，多在首尾兩端，中間分布較少;西瓜MYB基因含有的外顯子數(shù)量在1-4之間，76％的基因含有3個(gè)外顯子。而在不同長(zhǎng)度的外顯子中，有2種外顯子在結(jié)構(gòu)和分布上高度保守，大小分別為130bp和133bp，分布在基因兩端;多序

4、列聯(lián)配比對(duì)結(jié)果顯示這些轉(zhuǎn)錄因子都含有完整的R2、R3結(jié)構(gòu)域，其中R3的第一個(gè)色氨酸大部分被苯丙氨酸取代。
　　2、用RT-PCR技術(shù)分析了60個(gè)西瓜R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因在低溫、干旱、ABA和鹽脅迫下根和葉中的表達(dá)，共有42個(gè)基因檢測(cè)到表達(dá)，其中5個(gè)基因不受脅迫誘導(dǎo)而穩(wěn)定表達(dá)，37個(gè)基因參與脅迫響應(yīng)。2個(gè)基因在葉中同時(shí)參與低溫、干旱、ABA和鹽4種非生物脅迫響應(yīng)，21個(gè)基因同時(shí)參與2-3種非生物脅迫響應(yīng)，14個(gè)基因特異性只

5、參與1種非生物脅迫響應(yīng)。葉和根中響應(yīng)低溫脅迫的基因有16個(gè)，響應(yīng)干旱脅迫的基因有18個(gè)，響應(yīng)ABA脅迫的基因有20個(gè)，響應(yīng)鹽脅迫的基因有15個(gè)。
　　3、以5d左右苗齡的野生西瓜W001的無(wú)菌苗子葉為外植體，篩選了芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基，并對(duì)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)BA濃度為1mg/L時(shí)，外植體的誘導(dǎo)率最高，平均每個(gè)外植體的叢生芽數(shù)達(dá)6個(gè);再生芽在MS+KT(0.1、0.2、0.3mg/L)三種伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中都能正常

6、伸長(zhǎng);最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA0.05mg/L，生根率達(dá)62％。初步建立適用于野生西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的子葉再生系統(tǒng)。
　　4、根據(jù)ClMYB55轉(zhuǎn)錄因子基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，以西瓜97103幼苗為材料，克隆了ClMYB55轉(zhuǎn)錄因子基因的全長(zhǎng)cDNA和CDS序列。并將ClMYB55基因的CDS序列和植物表達(dá)載體PBI121連接，構(gòu)建了35S∷ClMYB55超量表達(dá)載體，命名為PBI55。
　　5、利用正交法，以野生西瓜子葉外植