西瓜低溫響應(yīng)MYB(Cla007586)轉(zhuǎn)錄因子的功能鑒定及互作蛋白分析.pdf

1、西瓜（Citrullus lanatus）是世界范圍內(nèi)廣泛栽培和食用的園藝作物，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。低溫是常見(jiàn)的環(huán)境脅迫因子，嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。西瓜屬于喜溫性作物，在早春和反季節(jié)設(shè)施栽培過(guò)程中，常常受到低溫脅迫，影響產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。研究西瓜低溫響應(yīng)基因的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不僅可以解析西瓜的低溫耐受性機(jī)制，也能為西瓜耐低溫品種的遺傳改良提供理論依據(jù)，具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。模式植物上的研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)低溫及抵御低溫過(guò)

2、程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本課題在前期研究中，從低溫脅迫下西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)的基因Cla007586，經(jīng)鑒定為一個(gè)典型的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子。該MYB轉(zhuǎn)錄因子是否具有調(diào)控西瓜低溫耐受性的功能及其是如何調(diào)控的，目前尚不清楚。為回答以上問(wèn)題，本研究克隆了該基因，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體對(duì)煙草進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，分析了過(guò)表達(dá)煙草植株在低溫脅迫下的表型和生理生化指標(biāo)的變化，同時(shí)，通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了其在西瓜中的潛在互作蛋白。主

3、要研究結(jié)果如下:
　　1.序列分析表明，Cla007586基因是一個(gè)典型的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)861 bp，編碼286個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)分別為32.6 kDa和5.79。低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，Cla007586基因受低溫脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)。
　　2.蛋白亞細(xì)胞定位表明Cla007586位于細(xì)胞核中。構(gòu)建了pK7FWG2-Cla007586植物表達(dá)載體并在本氏煙

4、草瞬時(shí)表達(dá)，通過(guò)激光共聚焦觀察煙草葉片表皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，綠色熒光僅位于細(xì)胞核中，且與細(xì)胞核染料DAPI的熒光重合。
　　3.煙草轉(zhuǎn)基因植株的獲得。構(gòu)建了pHellsgate8-Cla007586植物過(guò)表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化栽培煙草（Nicotiana tabacum L.cv.SR1）獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株，通過(guò)PCR和RT-PCR檢測(cè)，篩選了OE3和OE5過(guò)表達(dá)煙草株系，并收獲了T1代種子。
　　4.

5、過(guò)表達(dá)Cla007586基因降低了煙草植株的低溫抗性。正常培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型煙草植株的生長(zhǎng)及表型無(wú)明顯差別。4℃低溫脅迫處理后，與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因型煙草植株葉片表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的失水萎蔫現(xiàn)象，且細(xì)胞膜損傷程度、膜脂過(guò)氧化程度均高于野生型煙草植株。
　　5.Cla007586互作蛋白的篩選。構(gòu)建了西瓜低溫脅迫下葉片均一化cDNA文庫(kù)于Y187菌株，同時(shí)構(gòu)建了誘餌載體pGBKT7-Cla007586并轉(zhuǎn)化Y2HGo

6、ld菌株，在確保無(wú)自激活性和對(duì)酵母菌株生長(zhǎng)無(wú)毒性的前提下，將兩種酵母菌株混合培養(yǎng)，通過(guò)接合生殖，初步篩選出13個(gè)與Cla007586互作的蛋白。隨后從中選擇2個(gè)(A02和A10)已報(bào)道的與溫度脅迫相關(guān)的蛋白進(jìn)行了重點(diǎn)分析。A02編碼ω-3脂肪酸去飽和酶，在模式植物中的研究表明它能催化二烯脂肪酸轉(zhuǎn)化為三烯脂肪酸，改變膜內(nèi)不飽和脂肪酸含量提高植物的低溫抗性。A10編碼熱激轉(zhuǎn)錄因子，與溫度脅迫密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組分析表明這2個(gè)基因在西瓜低溫脅迫早