棉花纖維中DELLA互作蛋白的鑒定和功能分析.pdf

1、棉花(Gossypium hirsutum)是最重要的天然纖維作物，在我國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。纖維的生長(zhǎng)發(fā)育受包括多植物激素信號(hào)的多途徑網(wǎng)絡(luò)的控制。DELLA蛋白，是GA信號(hào)途徑中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子，其N末端能夠響應(yīng)GA信號(hào)；C末端具有GRAS域，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。由于缺乏典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，DELLA蛋白通常與其它調(diào)控蛋白結(jié)合，通過影響這些蛋白的功能而起作用。
　　乙烯作為一種重要的植物激素，能促進(jìn)陸地棉纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)。EIN3

2、（Ethylene insensitive3）是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植株的生長(zhǎng)發(fā)育，并作為乙烯與其他信號(hào)間交叉點(diǎn)發(fā)揮重要作用。
　　本實(shí)驗(yàn)從DELLA蛋白的互作蛋白入手，研究DELLA在纖維生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用。一方面，在全面鑒定棉花GhEIN3基因的基礎(chǔ)上，分析其進(jìn)化、分類、表達(dá)以及與DELLA蛋白的互作，進(jìn)一步用煙草瞬時(shí)表達(dá)分析兩種蛋白的互作對(duì)下游基因表達(dá)的影響。另一方面，我們構(gòu)建了陸地棉開花后10天和20

3、天的纖維cDNA文庫(kù)，利用DELLA做誘餌從文庫(kù)中篩選互作蛋白，并通過瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。主要結(jié)果如下：
　　1.誘餌蛋白的構(gòu)建和篩選
　　陸地棉存在4對(duì)DELLA基因，分別來(lái)自A亞基因組（GhGAI1A～4A）和來(lái)自D亞基因組（GhGAI1D～4D）。首先用GhGAI1D～4D的全長(zhǎng)或截短序列構(gòu)建酵母雙雜交(Y2H)的誘餌載體，檢測(cè)其自激活和細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，GhGAI1D和3D蛋白的C端GRAS區(qū)以及GhGAI1D的N區(qū)

4、沒有自激活作用和細(xì)胞毒性。進(jìn)一步檢測(cè)表明8個(gè)棉花DELLA蛋白的C端GRAS區(qū)均無(wú)自激活和細(xì)胞毒性，因此采用DELLA蛋白的C端GRAS區(qū)進(jìn)行后續(xù)的用于文庫(kù)篩選和蛋白互作檢測(cè)。
　　2．在陸地棉中DELLAs和GhEIN3s互作的全面分析
　　從陸地棉中鑒定出7對(duì)GhEIN3基因（GhEIIN3-1A～7A,GhEIN3-1D～7D），其編碼蛋白都具有EIN3的典型結(jié)構(gòu)域。表達(dá)分析表明4對(duì)GhEIN3基因（GhEIN3-1A

5、～4A，GhEIN3-1D～4D）在棉花中有明顯表達(dá)，且在不同組織和纖維不同時(shí)期的表達(dá)模式相似。乙烯處理能顯著上調(diào)體外培養(yǎng)纖維中GhEIN3-1A、1D、2D和3D的轉(zhuǎn)錄。瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)所有的GhEIN3s都能顯著激活含EBS（EIN3-binding site）的啟動(dòng)子，而且不同GhEIN3s對(duì)不同啟動(dòng)子的激活效率存在差異。說明GhEIN3可能在纖維發(fā)育中起著重要調(diào)控作用。
　　將GhEIN3-1～4A/D構(gòu)建在AD載體上，和8個(gè)

6、棉花DELLA的GRAS域的BD載體，兩兩進(jìn)行酵母雙雜交，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GhEIN3-1A與所有DELLA存在相互作用，而其他GhEIN3s不能與DELLA互作。在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，DELLA的互作抑制GhEIN3-1A對(duì)靶基因的激活作用。
　　DELLA通過與GhHOX3互作，可以抑制GhHOX3與pEXPA1和pRDL1的結(jié)合從而抑制基因表達(dá)。瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)GhEIN3-1A與DELLA的互作不能回復(fù)GhHOX3對(duì)EXPA1和RDL1的

7、激活作用。說明DELLA與GhEIN3-1A的互作可能對(duì)DELLA下游HOX3調(diào)控途徑無(wú)明顯影響。
　　3.DELLA互作蛋白的篩選
　　以GhGAI1D-GRAS為誘餌，在棉花開花后10天和20天的纖維cDNA文庫(kù)中篩選潛在互作蛋白，并通過共轉(zhuǎn)化和煙草瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證驗(yàn)證蛋白間的互作。最終鑒定出兩個(gè)陽(yáng)性的DELLA互作蛋白：C4類鋅指蛋白FYVE-D和CCCH類鋅指蛋白ZinCX8-D。
　　煙草瞬時(shí)表達(dá)和雙熒光酶活檢測(cè)