桑樹(shù)miRNA的鑒定及其在蠶?；プ髦械墓δ苎芯?pdf

1、研究利用寡食性昆蟲(chóng)-家蠶和桑葉這對(duì)組合，探究家蠶攝食桑葉后，桑樹(shù)的miRNA是否進(jìn)入了家蠶的體內(nèi)。利用Illumina高通量測(cè)序方法對(duì)野生桑（川桑）、栽培桑（湖桑32號(hào)和倫教109）葉片以及家蠶血淋巴小RNA進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，分析鑒定桑葉的miRNA，利用生物信息學(xué)方法分析家蠶血淋巴中是否存在桑樹(shù)源miRNA。采用莖環(huán)PCR、T-A克隆、Sanger測(cè)序驗(yàn)證該結(jié)果，并探究了桑樹(shù)源miRNA是否廣泛存在家蠶的組織中。利用微滴數(shù)字PCR技術(shù)檢

2、測(cè)人工合成的miR166b是否也能進(jìn)入家蠶的體內(nèi)。另外，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RT-PCR以及表型調(diào)查等方法探究桑樹(shù)源miR166b對(duì)家蠶的生理活動(dòng)是否有影響。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定川桑的保守miRNA和新miRNA
　　研究采用solexa技術(shù)對(duì)川桑3個(gè)組織（葉、皮和雄花）的小RNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，利用生物信息學(xué)方法，在川桑的3個(gè)組織中共鑒定到85個(gè)保守miRNA，分屬于31個(gè)家族，262個(gè)新m

3、iRNA，分別位于川?；蚪M的371個(gè)位點(diǎn)上。采用miRNA靶基因預(yù)測(cè)的方法，20個(gè)保守miRNA家族和113個(gè)新miRNA分別預(yù)測(cè)得到89和332個(gè)候選靶基因。
　　川桑保守miRNA的進(jìn)化保守性分析表明川桑大部分miRNA同其它雙子葉和單子葉植物都較為保守。表達(dá)水平分析表明川桑保守miRNA家族的表達(dá)水平范圍較廣，具有組織傾向性，葉、皮和雄花組織傾向性表達(dá)的miRNA家族分別是5個(gè)、5個(gè)和8個(gè)。RT-PCR結(jié)果顯示部分保守mi

4、RNA在葉、皮和雄花的表達(dá)譜模式同高通量測(cè)序結(jié)果一致。
　　川桑新miRNA的特點(diǎn)分析表明，新miRNA前體長(zhǎng)度范圍與其它已報(bào)道的植物相似;最小折疊自由能平均值低于tRNA和rRNA;鑒定到90個(gè)新miRNA對(duì)應(yīng)miRNA*序列，進(jìn)一步表明了新預(yù)測(cè)miRNA的準(zhǔn)確性。表達(dá)水平分析表明新miRNA的表達(dá)水平也較為寬廣，總體表達(dá)水平遠(yuǎn)低于保守miRNA，也具有組織傾向性，其中58個(gè)、84個(gè)和72個(gè)分別具有葉、皮和雄花組織傾向性表達(dá)模式

5、。選取部分新miRNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示其在3個(gè)組織的表達(dá)模式與高通量測(cè)序的結(jié)果一致。
　　本部分研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)鑒定了川桑保守miRNA、新miRNA以及其候選靶基因，對(duì)桑樹(shù)miRNA的功能分析和家蠶體內(nèi)是否有桑樹(shù)源miRNA的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　2.栽培桑miRNA的鑒定及其與野生桑miRNA的比較分析
　　之前我們對(duì)川桑（野生桑）葉片進(jìn)行了miRNA的鑒定，但是家蠶攝食的是栽培桑桑葉，于是

6、本部分研究采用solexa測(cè)序?qū)蓚€(gè)栽培桑品系（湖桑32號(hào)和倫教109）葉片miRNA進(jìn)行鑒定并比較分析了野生桑和栽培桑之間的差異。
　　結(jié)合miRBase的第21版釋放數(shù)據(jù)，共鑒定到兩個(gè)栽培桑品系以及川桑的保守miRNA分別是192個(gè)、180個(gè)和151個(gè)，湖桑32號(hào)和倫教109的新miRNA分別是177個(gè)和167個(gè)。三者共有的保守miRNA是137個(gè)，表明野生桑和栽培桑的miRNA種類差異不大。表達(dá)水平差異分析表明野生桑（川桑）

7、和栽培桑（湖桑32號(hào)和倫教109）的差異保守miRNA共有100個(gè)，其中75個(gè)miRNA在栽培桑中上調(diào)表達(dá)，25個(gè)下調(diào)表達(dá);差異新miRNA共有266個(gè)，其中89個(gè)新miRNA在栽培桑中上調(diào)表達(dá)，177個(gè)下調(diào)表達(dá)，雖然差異表達(dá)的miRNA數(shù)目較多，但是表達(dá)量高的差異表達(dá)miRNA較少，RPM值在100以上的只有6個(gè)。說(shuō)明了野生桑（川桑）和兩個(gè)栽培桑miRNA整體的表達(dá)水平大同小異。同時(shí)我們也分析了這些差異miRNA可能與川桑和栽培桑之間

8、的關(guān)系。差異表達(dá)miRNA對(duì)應(yīng)靶基因的KEGG分析表明，野生桑和栽培桑參與碳水化合物和氨基酸代謝的差異miRNA對(duì)應(yīng)靶基因數(shù)目最多，暗示了二者在糖類和蛋白質(zhì)含量可能有所差異。
　　本部分研究表明栽培桑和野生桑在miRNA的種類和表達(dá)水平上大同小異，說(shuō)明用川桑數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步的分析是可行的。
　　3.家蠶血淋巴小RNA種類的鑒定和分析
　　為探究家蠶體內(nèi)是否有桑樹(shù)源miRNA，本部分研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)家蠶血淋巴小RN

9、A文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)分析共鑒定的小RNA種類包括:桑樹(shù)源miRNA，家蠶的miRNA、tsRNA、rRNA、snRNA以及snoRNA。
　　家蠶血淋巴小RNA和桑樹(shù)miRNA的比對(duì)分析結(jié)果表明，家蠶血淋巴中有8個(gè)桑樹(shù)源miRNA，包括mno-miR166b，mno-miR166c，mno-miR167e，mno-miR396b, mno-miR156c,mno-miR398, mno-miR162, mno-miR159a，其總

10、體的表達(dá)量非常低，最高的reads數(shù)只有11。該結(jié)果表明家蠶攝食桑葉后，部分桑樹(shù)miRNA能夠穿過(guò)家蠶的消化道進(jìn)入家蠶的體內(nèi)，但是由于檢測(cè)到的桑樹(shù)源miRNA含量較低，也不能排除這一結(jié)果是由于高通量測(cè)序帶來(lái)的誤差或是樣品收集過(guò)程中桑葉帶來(lái)的污染。
　　家蠶血淋巴小RNA和已報(bào)道的家蠶miRNA的比對(duì)結(jié)果表明，家蠶血淋巴中共有133個(gè)已知miRNA和6個(gè)新miRNA，其整體表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其在家蠶的其它組織（例如脂肪體、絲腺等），推

11、測(cè)其原因可能是血淋巴中的miRNA大部分來(lái)源于血細(xì)胞中的miRNA和組織細(xì)胞分泌的miRNA。
　　此外，我們還發(fā)現(xiàn)，血淋巴小RNA長(zhǎng)度分布結(jié)果表明血淋巴中含量最高的小RNA是tRNA衍生的小RNA(tsRNA)，分別占據(jù)兩個(gè)小RNA文庫(kù)總量的86.99％和92.04％，長(zhǎng)度分布主要在25-28nt區(qū)間。tsRNA分類結(jié)果表明，家蠶血淋巴中含量前2位分別是tsRNA-Asp(GAC)和tsRNA-His(CAC)。以上兩種tsRN

12、A在其對(duì)應(yīng)的tRNA的位置分布結(jié)果表明幾乎99％都位于tRNA的5'端。此外，tsRNA-Asp(GAC)和tsRNA-His(CAC)在家蠶體液和組織中的表達(dá)水平分析表明，這兩個(gè)tsRNA僅在家蠶血淋巴中高量表達(dá)，在全蠶、脂肪體和絲腺中極微量表達(dá)，以上結(jié)果暗示家蠶的tsRNA-Asp(GAC)和tsRNA-His(CAC)可能在血淋巴中起著特殊的作用。
　　該研究利用二代測(cè)序法和生物信息學(xué)方法對(duì)家蠶血淋巴的小RNA種類進(jìn)行了分析

13、，對(duì)家蠶血淋巴中miRNA、tsRNA的功能研究和桑樹(shù)源miRNA跨界轉(zhuǎn)運(yùn)到家蠶的研究提供了數(shù)據(jù)支撐。
　　4.桑樹(shù)miR166b對(duì)家蠶的跨界調(diào)節(jié)研究
　　家蠶血淋巴小RNA和桑樹(shù)miRNA的比對(duì)分析結(jié)果顯示，家蠶血淋巴中有8個(gè)桑樹(shù)源miRNA。本研究對(duì)桑樹(shù)源的miRNA是否真正進(jìn)入了家蠶體內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證，并研究了進(jìn)入家蠶體內(nèi)的桑樹(shù)源miRNA對(duì)家蠶的生理功能是否有作用。
　　莖環(huán)PCR、T-A克隆和Sanger測(cè)序結(jié)果

14、顯示:7個(gè)桑樹(shù)源的miRNA(mno-miR166b,mo-miR166c,mno-miR167e,mno-miR396b,mno-miR156c,mno-miR398和mno-miR159a)進(jìn)入了家蠶的血淋巴中，通過(guò)與對(duì)照miR169a的測(cè)序頻率比較，證明了這7個(gè)桑樹(shù)源miRNA不是來(lái)自大規(guī)模測(cè)序的污染，也非樣品收集過(guò)程中桑葉帶來(lái)的污染，是真實(shí)存在家蠶的血淋巴中。此外，克隆測(cè)序結(jié)果表明桑樹(shù)源的4個(gè)miRNA(mno-miR166b，

15、mno-miR166c，mno-miR167e和mno-miR396b)能進(jìn)入家蠶的9個(gè)組織（脂肪體、絲腺、腦、卵巢、中腸、涎腺、精巢、前胸腺和馬氏管）。微滴數(shù)字化PCR(ddPCR)結(jié)果表明人工合成的miR166b在被家蠶攝食后，能進(jìn)入家蠶的血淋巴和脂肪體中，然而該miRNA僅能在家蠶體內(nèi)持續(xù)保持約3小時(shí)便被降解。
　　RT-PCR結(jié)果表明miR166b的11個(gè)候選靶基因在喂食人工合成miR166b前后的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，暗

16、示了miR166b在家蠶中沒(méi)有功能或是這11個(gè)基因不是miR166b的靶基因。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的進(jìn)一步分析結(jié)果表明，5齡2天的雄蠶被喂食人工合成的miR166b之后與其被喂食前相比較，全蠶的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組共有30個(gè)差異表達(dá)基因，其中17個(gè)上調(diào)基因，13個(gè)下調(diào)基因?；蚍诸惐砻鞴灿?2個(gè)基因涉及免疫和響應(yīng)壓力，占據(jù)30個(gè)差異表達(dá)基因的40％，我們推測(cè)通過(guò)攝食進(jìn)入家蠶體內(nèi)的人工合成miR166b可能激發(fā)了家蠶抵抗非自我分子。6個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs

17、)的RT-PCR結(jié)果顯示其中有3個(gè)DEGs在喂食了人工合成miR166c和/或miR167e后上調(diào)和/或下調(diào)表達(dá)，該結(jié)果暗示了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的12個(gè)與免疫和壓力相關(guān)的DEGs表達(dá)水平變化的發(fā)生不是由于喂食的miR166b的序列引起，而是miR166b這種核酸物質(zhì)造成的。表型調(diào)查表明喂食miR166b和沒(méi)有喂食miR166b的家蠶在幼蟲(chóng)重量的增加倍數(shù)、進(jìn)入熟蠶期的比率、致死率、蛹和繭殼重量等方面沒(méi)有顯著差異。此外，我們還預(yù)測(cè)了miR166

18、b在30個(gè)差異表達(dá)基因中是否有作用的靶位點(diǎn)，結(jié)果表明沒(méi)有重要的靶位點(diǎn)。以上結(jié)果都表明了桑樹(shù)miR166b對(duì)家蠶的生理活動(dòng)基本沒(méi)有影響。
　　綜合上文高通量測(cè)序、克隆測(cè)序?qū)嶒?yàn)、ddPCR檢測(cè)以及喂食人工合成miR166b的轉(zhuǎn)錄組分析、RT-PCR檢測(cè)和表型調(diào)查的結(jié)果，我們認(rèn)為桑葉中的miRNAs能通過(guò)家蠶攝食桑葉的方式進(jìn)入家蠶的血淋巴和9個(gè)組織中，人工合成miR166b也能進(jìn)入家蠶的血淋巴和脂肪體，然而喂食的人工合成miR166b對(duì)