棉花與黃萎病菌的分子互作機(jī)制研究及GbWRKY1基因的功能鑒定.pdf

1、棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的土傳真菌維管束病害，發(fā)病時(shí)會(huì)引起棉花葉片失綠變黃，蕾鈴脫落，嚴(yán)重時(shí)造成棉株死亡，是當(dāng)前影響棉花生產(chǎn)的主要病害之一。了解棉花與黃萎病菌互作的分子機(jī)制，分離抗病相關(guān)基因并利用基因工程技術(shù)對(duì)現(xiàn)有陸地棉品種進(jìn)行抗性改造，已成為當(dāng)前棉花分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。本研究分別構(gòu)建了抗黃萎病的海島棉‘海7124’接種黃萎病菌后的抑制差減雜交cDNA文庫(kù)以及通過(guò)大規(guī)模測(cè)序的RNA-Seq技術(shù)研究棉花抗黃萎病機(jī)制。通過(guò)基因

2、表達(dá)分析，獲得了大批棉花抗黃萎病相關(guān)基因，并對(duì)其中的一個(gè)WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了較為詳細(xì)的功能研究，取得的主要結(jié)果如下：
　　 1、構(gòu)建了‘海7124’受黃萎病菌接種后的抑制差減雜交cDNA文庫(kù)。對(duì)得到的211個(gè)差異表達(dá)基因功能分類(lèi)表明主要包括代謝類(lèi)相關(guān)基因、生物及非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)基因、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因等，此外有38%左右的基因未在數(shù)據(jù)庫(kù)中得到功能注釋或者功能注釋為未知功能蛋白。一些已知的植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的基因，如

3、PR蛋白、氧爆發(fā)相關(guān)基因以及一些次生代謝相關(guān)的基因等在‘海7124’接種黃萎病菌后受誘導(dǎo)表達(dá)明顯。此外一些參與基因表達(dá)調(diào)控類(lèi)基因，如WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子、MAPK類(lèi)蛋白激酶等信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因也在棉花抗黃萎病反應(yīng)中差異表達(dá)明顯。對(duì)這些參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)調(diào)控類(lèi)基因的詳細(xì)分析會(huì)將有助于深入了解棉花抗黃萎病病反應(yīng)的分子機(jī)制。運(yùn)用Nothern雜交、RT-PCR和qRT-PCR技術(shù)對(duì)分離得到的這些差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)它們?cè)谝恍┬盘?hào)分子，如乙

4、烯、茉莉酸、水楊酸及H2O2等處理后的表達(dá)模式進(jìn)行分析，推測(cè)棉花抗黃萎病反應(yīng)所參與的信號(hào)路徑。研究發(fā)現(xiàn)，乙烯作為重要的一類(lèi)抗病信號(hào)分子可能在棉花抗黃萎病反應(yīng)中具有重要作用。
　　 2、為了進(jìn)一步了解棉花抗黃萎病分子機(jī)制，我們利用RNA-Seq大規(guī)模測(cè)序分析技術(shù)對(duì)‘海7124’接種黃萎病菌后4h、12 h、24 h和48 h的不同時(shí)間點(diǎn)取樣研究參與棉花抗黃萎病反應(yīng)的基因表達(dá)變化。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選及比對(duì)分析，共獲得3442個(gè)差異表達(dá)基

5、因。為了驗(yàn)證RNA-Seq大規(guī)模測(cè)序表達(dá)譜分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們選取了不同功能分類(lèi)、不同表達(dá)模式的361個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明兩種基因表達(dá)模式結(jié)果基本吻合，可對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，它們主要參與代謝類(lèi)相關(guān)途徑和應(yīng)對(duì)外界的刺激相關(guān)反應(yīng)。我們對(duì)其中參與植物抗病免疫反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的四類(lèi)基因包括富含亮氨酸重復(fù)的類(lèi)受體激酶、激素信號(hào)路徑相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因及次生代謝苯丙環(huán)類(lèi)路徑相關(guān)

6、基因進(jìn)行了深入分析。研究表明大多數(shù)苯丙環(huán)類(lèi)物質(zhì)代謝路徑基因都參與了棉花與黃萎病菌的分子互作，并在抗病的‘海7124’和感病的陸地棉品系‘YZ-1’中均受黃萎病菌誘導(dǎo)，但在抗病材料中這些基因被誘導(dǎo)的速度和表達(dá)水平都高于感病的陸地棉。酶活檢測(cè)的結(jié)果與基因表達(dá)分析的結(jié)果相似。采用組織化學(xué)檢測(cè)的方法對(duì)接菌前后‘海7124’和‘YZ-1’的木質(zhì)素沉積和維管結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示抗病材料的木質(zhì)素合成增強(qiáng)并在次生壁中的積累和沉積使得維管結(jié)

7、構(gòu)增強(qiáng)了對(duì)病原菌的抗性，在海島棉對(duì)黃萎病的抗性中起著重要作用。
　　 3、Gb WRKY1是從海島棉中克隆得到的一個(gè)受黃萎病菌誘導(dǎo)的WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GbWRKY1與擬南芥AtWRKY75相似性較高，同屬于第二類(lèi)C亞組的WRKY蛋白。通過(guò)在擬南芥中超量表達(dá)該基因發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥能有效緩解對(duì)低磷逆境脅迫的反應(yīng)，包括減少花青素的積累和更多的生物學(xué)產(chǎn)量。研究還表明，在正常條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥的側(cè)根數(shù)增多、磷酸酶活性增

8、強(qiáng)以及植株體內(nèi)無(wú)機(jī)磷和總磷含量增加。對(duì)一系列受磷饑餓誘導(dǎo)基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是磷轉(zhuǎn)運(yùn)子基因還是磷饑餓誘導(dǎo)相關(guān)基因，在低磷處理后轉(zhuǎn)基因擬南芥中受誘導(dǎo)程度都低于野生型。由此推論，GbWRKY1可能是緩解磷饑餓脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中的一個(gè)正調(diào)控因子，在擬南芥中該基因的超量表達(dá)能在正常條件下模擬磷饑餓的信號(hào)，激活植物的低磷反應(yīng)，包括側(cè)根增多，體內(nèi)積累吸收更多的磷，從而能在低磷處理下能夠緩解植物的低磷脅迫反應(yīng)。由于生長(zhǎng)素對(duì)低磷脅迫反應(yīng)有重要的調(diào)控機(jī)制，