人工合成抗菌肽抑制棉花黃萎病菌的機(jī)制及應(yīng)用研究.pdf

1、我國(guó)是全球最大的棉花生產(chǎn)國(guó)，同時(shí)也是最大的消費(fèi)國(guó)。棉花的生產(chǎn)和創(chuàng)收對(duì)于我國(guó)的國(guó)民經(jīng)濟(jì)意義重大。然而根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局提供的數(shù)據(jù)，2010年全國(guó)棉花的總產(chǎn)量（596.1萬(wàn)噸）和單產(chǎn)(1229kg/ha)均為近五年來(lái)最低。除去人力不可控的氣候?yàn)?zāi)害的影響，棉花病害的發(fā)生是限制單產(chǎn)的主要因子。本研究的對(duì)象就是危害棉花最嚴(yán)重病害之一——黃萎病，該病是海關(guān)出入境的檢驗(yàn)檢疫對(duì)象，困擾棉花產(chǎn)業(yè)幾十年，一直未找到理想的防治對(duì)策。植物轉(zhuǎn)基因抗病育種技術(shù)的不斷發(fā)

2、展，為棉花黃萎病的攻克開(kāi)辟了新的途徑，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者也進(jìn)行了相關(guān)的嘗試。遺憾的是，截止到目前仍然沒(méi)有一個(gè)抗病的轉(zhuǎn)基因株系轉(zhuǎn)化為品種。究其原因應(yīng)該是轉(zhuǎn)化的外源抗病基因不夠理想，不能像蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素基因(BT)那樣強(qiáng)效。因此，分離和發(fā)現(xiàn)高效抗病的外源基因成為當(dāng)前轉(zhuǎn)基因抗黃萎病棉花品種選育工作中亟需解決的問(wèn)題。
　　 為此，本文以長(zhǎng)江和黃河流域棉花兩大主產(chǎn)區(qū)的15種黃萎病菌為材料，精心設(shè)計(jì)并合成了20條不同類型的抗真菌多肽，通過(guò)

3、分析抗菌肽與不同黃萎病菌、抗菌肽與動(dòng)物細(xì)胞、抗菌肽與棉花原生質(zhì)體間的互作，篩選出能高效抑殺黃萎病菌、低毒性的小分子多肽;探討了抗菌肽抑制黃萎病菌的可能作用機(jī)制和在大腸桿菌生物反應(yīng)器中原核表達(dá)該多肽的可行性。研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.對(duì)來(lái)自長(zhǎng)江和黃河流域兩大主產(chǎn)棉區(qū)的15種黃萎病菌的地方小種進(jìn)行了系統(tǒng)研究，首先，通過(guò)菌落形態(tài)學(xué)觀察將不同的菌系按照其菌絲和微菌核的相對(duì)生長(zhǎng)量分別劃分到菌絲型、菌核型和中間型，為直觀地初步判定不同

4、地方小種奠定了基礎(chǔ);其次，利用4對(duì)特異引物對(duì)上述病菌材料進(jìn)行了PCR分子鑒定，發(fā)現(xiàn)除枯萎病菌對(duì)照外，其他供試菌種均為大麗輪枝菌，并且部分為強(qiáng)致病力的落葉型菌系。苗期接種試驗(yàn)表明，黃萎病菌可能的致病因子——毒素（蛋白-脂-多糖復(fù)合物）對(duì)棉苗有明顯的致萎活性，通過(guò)進(jìn)一步比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，棉苗的抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)毒素和分生孢子液的響應(yīng)模式存在明顯的差異，毒素處理后棉苗的反應(yīng)更加迅速（特別是根部），同一處理的不同器官內(nèi)的防御酶活性變化也不相同。

5、　　 2.采用溫室鑒定和病圃鑒定相結(jié)合的方法，觀察了黃萎病菌在棉花上的發(fā)生與危害情況，并對(duì)本課題組現(xiàn)有的三系雜交棉材料進(jìn)行了為期2年的調(diào)查鑒定。其中，2007年8月份30℃以上的月均溫度以及同期較高的旬均溫度導(dǎo)致田間發(fā)生了黃萎病隱癥的情況，直到8月底才出現(xiàn)較高的病情指數(shù)。2008年田間病田的發(fā)病比較嚴(yán)重（同期溫度較2007年低很多，雨水足，適宜發(fā)病）。比較不同時(shí)期、不同材料的田間發(fā)病規(guī)律，結(jié)論是未發(fā)現(xiàn)免疫水平的材料。本試驗(yàn)用到的16個(gè)

6、三系雜交棉材料可以劃分為4個(gè)類群，海島棉恢復(fù)系具有高抗特性，雞腳葉恢復(fù)系和對(duì)照“湘雜棉2號(hào)”為高感病，其他多數(shù)材料均為耐病性或介于耐病與感病之間。相關(guān)性分析結(jié)果表明，各三系材料最終產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的表現(xiàn)與黃萎病的發(fā)病程度相關(guān)顯著。陸地棉雜交種和海陸雜種F1組合的各項(xiàng)指標(biāo)均有所改良，但未表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。
　　 3.收集國(guó)內(nèi)外各種數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道的抗菌肽序列1500多條，找出有抗真菌特性的600條，最終選定20條為母體肽，分別利

7、用不同的抗菌肽修飾手段，對(duì)母體肽進(jìn)行加工修飾，保留其保守的抗菌核心區(qū)（或氨基酸殘基），得到新型的潛在抗黃萎病菌多肽20條，體外人工合成后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同的抗菌肽對(duì)黃萎病菌的作用差異很大，同一抗菌肽對(duì)不同的黃萎病菌小種之間也存在差異。經(jīng)過(guò)篩選得到抗菌肽θ-防御素類BTD-S和雜合肽CM-S可以分別抑制全部5種或其中4種供試黃萎病菌，并且最小抑菌濃度均在5μM以下，二者均表現(xiàn)了很強(qiáng)的抑菌能力，比目前研究利用最成熟的多肽D4E1效

8、果好(MIC=9.61μM)，而且抑菌力更持久。分別用綿羊血紅細(xì)胞和棉花原生質(zhì)體為材料，對(duì)BTD-S和CM-S的生物安全性進(jìn)行了評(píng)定，結(jié)果表明，二者僅在濃度達(dá)到200μg/ml時(shí)才會(huì)出現(xiàn)輕微的溶血性，對(duì)棉花原生質(zhì)體在200μg/ml時(shí)未發(fā)現(xiàn)毒害性。
　　 4.通過(guò)生物信息學(xué)分析得出BTD-S為β-折疊肽，CM-S為α-螺旋肽。隨后利用圓二色譜技術(shù)測(cè)定了2種多肽分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，BTD-S在遠(yuǎn)紫外區(qū)的CD譜特征為195 nm處正峰，

9、205 nm處負(fù)峰，為典型的β-折疊構(gòu)象;CM-S則在190 nm處正峰，222 nm和208 nm處出現(xiàn)明顯的負(fù)峰，為α-螺旋構(gòu)象，試驗(yàn)測(cè)定的數(shù)據(jù)與軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果完全一致?？咕牡母呒?jí)結(jié)構(gòu)分析表明，BTD-S分子內(nèi)6個(gè)半胱氨酸結(jié)合為3對(duì)二硫鍵，呈梯狀，整條多肽結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，為其持久殺菌特性提供了可能;CM-S為α-螺旋，帶7個(gè)凈正電荷，分子具有兩親特性（有明顯的疏水表面），這些特質(zhì)使其更容易通過(guò)膜作用機(jī)制抑菌。
　　 5.在普

10、通光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，20μg/ml抗菌肽的處理會(huì)導(dǎo)致病菌分生孢子無(wú)法正常萌發(fā)，并出現(xiàn)部分小號(hào)細(xì)胞群體;利用熒光顯微技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)抗菌肽處理的真菌孢子細(xì)胞膜受到嚴(yán)重?fù)p傷，大分子碘化丙啶(PI)滲入病菌細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞核被染色，經(jīng)熒光激發(fā)顯紅色;掃描電鏡(SEM)觀察抗菌肽對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，BTD-S處理后真菌孢子不能萌發(fā)，細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯的外滲物，甚至發(fā)生細(xì)胞的破裂和解體，CM-S處理后也見(jiàn)到類似的現(xiàn)象，由此可見(jiàn)，BTD-S和CM-S都能與病

11、原真菌細(xì)胞膜互作，改變膜的透性，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)必需物質(zhì)外滲。流式細(xì)胞儀分析表明，BTD-S處理會(huì)使病菌細(xì)胞群體中逐漸分化出一批小號(hào)細(xì)胞，并且隨著B(niǎo)TD-S濃度的增加，該類小號(hào)細(xì)胞的群體呈明顯擴(kuò)大趨勢(shì)，這一結(jié)果與光學(xué)鏡下的發(fā)現(xiàn)相吻合;另一方面隨著B(niǎo)TD-S處理劑量的加大，病菌細(xì)胞對(duì)PI的吸收顯著增強(qiáng)，即細(xì)胞受損傷（或死亡）程度逐漸加重。
　　 6.根據(jù)BTD-S的氨基酸序列反譯為DNA序列，將編碼DNA序列插入到原核表達(dá)載體pET3