棉花黃萎病抗菌肽基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的黃萎病是棉花的主要病害之一,它嚴(yán)重影響了棉花的生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)室武翠紅碩士分離篩選出了一株對(duì)大麗輪枝菌有較強(qiáng)抗菌活性的新菌株一解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)RS-25,對(duì)此菌株的蛋白進(jìn)行了分離純化,得到表觀分子量為9 kD的單一活性組分,命名為A2,EDMAN降解法測(cè)得其N(xiāo)端序列為ASGGTVGIYGANMRS。本論文在此工作基

2、礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)研究,重點(diǎn)研究了棉花黃萎病抗菌肽全長(zhǎng)基因和成熟肽基因的克隆及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)。
　　 將A2的N端15個(gè)氨基酸在NCBI上進(jìn)行比對(duì),結(jié)合菌株的16S rDNA結(jié)果,得到一段100％同源蛋白序列。根據(jù)此同源蛋白對(duì)應(yīng)的編碼序列對(duì)新型抗菌肽全長(zhǎng)基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-a2q1,并對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果表明:此抗菌肽基因a2q1全長(zhǎng)354 bp,編碼117個(gè)氨基酸,其中第42～56位氨基酸與武

3、分離純化的抗菌肽A2的N端15個(gè)氨基酸完全相同。本研究得到的蛋白在N端比抗菌肽A2多出41個(gè)氨基酸,分析這41個(gè)氨基酸可能起調(diào)控作用,而武分離純化的抗菌肽A2為成熟肽。將重組質(zhì)粒pET-30a-a2q1利用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE顯示胞內(nèi)具有目的條帶,表達(dá)產(chǎn)物表觀分子量為19 kD。用鎳柱親和層析的方法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化,SDS-PAGE顯示在19 kD有單一條帶。大麗輪枝菌抑菌試驗(yàn)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其無(wú)

4、抑菌活性。本研究克隆表達(dá)的目的蛋白A2Q1比武分離純化的抗菌肽A2多41個(gè)氨基酸,為驗(yàn)證是否是此41個(gè)氨基酸影響蛋白活性,以及獲得具有抗菌活性的重組蛋白,對(duì)成熟肽片段進(jìn)行了研究。
　　 對(duì)成熟肽基因設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-a2c,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),鎳柱親和層析,SDS-PAGE顯示在14 kD有單一條帶,由于成熟肽A2C與載體His標(biāo)簽融合,故表觀分子量比武分離純化的抗菌肽A2(9 kD)略大。經(jīng)檢

5、測(cè),發(fā)現(xiàn)A2C也無(wú)抑菌活性。綜上分析可能是由于抗菌肽A2為糖蛋白(武報(bào)道),而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺乏糖基化功能,所以表達(dá)的蛋白A2Q1、A2C沒(méi)有活性。
　　 酵母表達(dá)系統(tǒng)具有糖基化功能,故選取畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行以下研究。對(duì)全長(zhǎng)基因設(shè)計(jì)引物(引入組氨酸標(biāo)簽),構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-a2q2,線性化后,用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)甲醇低溫誘導(dǎo),鎳柱親和層析,SDS-PAGE顯示在19 kD有單一條帶。經(jīng)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)表達(dá)