團(tuán)頭魴三個(gè)抗菌肽基因的鑒定與表達(dá)研究.pdf

1、NK-LYSIN是機(jī)體自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NKL)和毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)分泌的小分子陽(yáng)離子抗菌肽，同人類顆粒溶素granulysin是同源多肽，具有廣譜的抗菌活性，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、癌細(xì)胞等均有生物活性。組蛋白H2A是真核生物體細(xì)胞染色質(zhì)中的一種結(jié)構(gòu)蛋白，是先天性免疫的組成成分之一，其衍生的多肽片段的殺菌作用已成為目前的研究熱點(diǎn)。
　　團(tuán)頭魴（M

2、egalobrama amblycephala）是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，集約化程度的提高以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，導(dǎo)致各類疾病頻發(fā)。其中，對(duì)團(tuán)頭魴養(yǎng)殖影響最大的疾病是由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染引起的細(xì)菌性敗血癥，可造成魚(yú)體各部位充血、潰瘍、腹腔積水和肝臟發(fā)白等癥狀，從而導(dǎo)致魚(yú)體大量死亡。另外，現(xiàn)階段還沒(méi)有很好的藥物可以控制，養(yǎng)殖業(yè)中則主要使用抗生素提高魚(yú)體免疫力，但抗生素會(huì)造成藥物殘留

3、和細(xì)菌耐藥性，嚴(yán)重影響水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和人類健康，新型抗菌藥物的研發(fā)成為熱點(diǎn)。
　　本研究從團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組中釣取到2個(gè)NK-lysin基因（nkla和nklb）和1個(gè)H2A基因，通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證其ORF序列，并分析序列特征。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在團(tuán)頭魴胚胎發(fā)育不同時(shí)期以及成魚(yú)組織和嗜水氣單胞菌感染后免疫組織中的表達(dá)。構(gòu)建團(tuán)頭魴2個(gè)NK-lysin基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)

4、一步研究NK-lysin的功能奠定了基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.團(tuán)頭魴3個(gè)抗菌肽基因(nkla、nklb和H2A)的序列分析
　　nkla ORF全長(zhǎng)369bp，編碼122個(gè)氨基酸，DNAstar預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)為6.71，分子質(zhì)量為14kDa; nklb ORF全長(zhǎng)411bp，編碼136個(gè)氨基酸，DNAstar預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)為6.72，分子質(zhì)量為15.6kDa。多氨基酸序列比對(duì)分析顯示，nkla和nklb的N端均含有信

5、號(hào)肽，6個(gè)高度保守半胱氨酸，可形成3對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，以及1個(gè)SapB結(jié)構(gòu)域，序列分析發(fā)現(xiàn)它屬于鞘脂激活蛋白樣蛋白家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，團(tuán)頭魴NK-lysin基因與斑馬魚(yú)親緣關(guān)系最近，其次是半滑舌鰨和斑點(diǎn)叉尾鮰。組蛋白H2A基因ORF全長(zhǎng)387bp，編碼128個(gè)氨基酸，DNAstar預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)為10.92，分子質(zhì)量為16.2kDa。H2A氨基酸序列不含跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽，且其序列十分保守，不同物種間序列相似性極高。
　　2.

6、團(tuán)頭魴3個(gè)抗菌肽基因在不同發(fā)育時(shí)期及成魚(yú)各組織中的表達(dá)
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示，nkla和nklb在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期廣泛表達(dá)。在胚胎發(fā)育的初始階段，nkla和nklb呈低表達(dá)，而在出膜期時(shí)，nkla和nklb表達(dá)量快速上升。其中，nkla在眼球色素出現(xiàn)期達(dá)到最高表達(dá)，nklb在出膜后1d時(shí)達(dá)到最高值。H2A也在胚胎發(fā)育期廣泛表達(dá)，且在出膜后7d達(dá)到最高值。
　　在健康團(tuán)頭魴各組織中，nkla在脾臟中表達(dá)量極高，為其他組

7、織中的數(shù)百倍，而在肌肉、血中表達(dá)量極低，在肝臟、腦、腎臟、頭腎、腸、鰓和心中均有明顯表達(dá);nklb則在腸中表達(dá)量相對(duì)較高，在脾臟、頭腎表達(dá)相對(duì)較低，在其他組織中均表達(dá)。nkla和nklb不同的表達(dá)模式暗示著不同的NK-lysin可能存在功能上的分化。H2A在血中表達(dá)量最高，腦中其次，其他組織中表達(dá)量相對(duì)較低。
　　3.團(tuán)頭魴3個(gè)抗菌肽基因在嗜水氣單胞菌感染后的表達(dá)
　　嗜水氣單胞菌感染后，團(tuán)頭魴nkla和nklb兩個(gè)基因在不

8、同組織中的表達(dá)變化模式相似:在頭腎中，nkla在感染后表達(dá)顯著性下降，nklb則在4h、24h及120h時(shí)呈顯著下降水平;在肝臟中，均在4h時(shí)上升到最高水平，而后回落;在脾臟中，則在72h升到最高水平，120h恢復(fù)正常;在腸中，nkla和nklb表達(dá)量在4h時(shí)顯著降低，并分別在72h和24h時(shí)達(dá)到最高值，120h回到正常水平。nkla和nklb在主要免疫組織中的表達(dá)變化，暗示著它們可能在團(tuán)頭魴抵抗嗜水氣單胞菌侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。H2

9、A基因在肝臟和腸中的表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)，在脾臟和腎臟中，H2A的表達(dá)則是先呈下降趨勢(shì)，而后顯著上升。
　　4.團(tuán)頭魴nkla和nklb的原核表達(dá)
　　成功構(gòu)建了3種nkla和nklb的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入到BL21(DE3)宿主菌中，獲得原核表達(dá)菌株，對(duì)IPTG濃度、溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等各條件進(jìn)行優(yōu)化。在pET32a-NKLA和pET32a-NKLB重組表達(dá)體系中，融合蛋白NKLA只在沉淀中表達(dá)，NKLB則在上清和沉淀中表達(dá)，但該

10、表達(dá)體系不穩(wěn)定。而對(duì)于pET28a-NKLA和pET28a-NKLB表達(dá)體系，NKLA沒(méi)有表達(dá)，NKLB在沉淀中只有少量表達(dá)。在pGEX-NKLA和pGEX-NKLB表達(dá)體系中，融合蛋白主要以包涵體形式存在，分子量分別為38.2kDa和39.7kDa，且該表達(dá)體系較穩(wěn)定。選擇誘導(dǎo)時(shí)間為8h，在不同IPTG終濃度和各溫度條件下，融合蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯差異，其中融合蛋白NKLA在37℃下IPTG濃度為0.05mmol/L時(shí)，目的蛋白占菌體總