家蠅抗菌肽相關(guān)基因芯片的制備和應(yīng)用及一個新抗菌肽基因的克隆分析.pdf

1、抗菌肽(antibacterial peptides，簡稱ABP)是一類由結(jié)構(gòu)基因編碼產(chǎn)生的小分子肽類物質(zhì)，廣泛存在于生物體內(nèi)，是構(gòu)成其自身免疫體系的重要組分，能非特異性的抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原體，且對腫瘤細胞、多重耐藥菌也有明顯的殺傷作用，且對正常生物體細胞無害，作用的機理非常獨特，是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕?，成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究中的一大研究熱點。 家蠅從幼蟲到成蟲常生活在垃圾堆、禽畜糞便等有多種病原菌

2、孳生的環(huán)境中，攜帶多種有害病原微生物，能在人、畜中通過機械傳播多種疾病，自身卻不會因為感染病原菌而死亡，這可能緣于其獨特的天然免疫活性物質(zhì)抵抗各種微生物的浸染，抗菌肽在其中起著主要的作用。家蠅在我國分布廣泛，容易飼養(yǎng)，且養(yǎng)殖的成本較低，在醫(yī)藥開發(fā)應(yīng)用方面是一個很好的昆蟲資源。但從家蠅體內(nèi)提取天然抗菌活性物質(zhì)的成本較高，人工合成也較昂貴，通過基因工程方法可能是規(guī)模制備其抗菌肽的理想途徑之一，而該方法的前提是要獲取其有關(guān)的抗菌肽基因。

3、 基因芯片技術(shù)是近年來新興的一種分子生物學(xué)技術(shù)，具有快速、高效、敏感、平行性等許多優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)方法一次只能研究一條或少數(shù)幾條基因的局限性，在基因差異表達的篩選、新基因的發(fā)現(xiàn)、突變基因的檢測及基因多態(tài)性分析等方面顯示出了很好的應(yīng)用前景。用該技術(shù)用于家蠅抗菌肽相關(guān)基因的篩選研究還未見報道，本研究以GenBank中部分昆蟲抗菌肽基因序列為目標設(shè)計寡核苷酸(oligonucleotide)探針，制備成寡核苷酸（oligo）芯片，以篩選家蠅

4、抗菌肽相關(guān)基因，并對所篩選出的其中一個基因的cDNA序列進行克隆，運用生物信息學(xué)軟件進行初步分析。 研究目的 運用基因芯片技術(shù)篩選家蠅抗菌肽相關(guān)基因，對其中篩選出的一個基因的cDNA序列進行克隆分析，為進一步研究家蠅抗菌肽結(jié)構(gòu)和功能，揭示其在家蠅天然免疫體系中所起的作用，進而為用基因工程方法生產(chǎn)家蠅抗菌肽打下基礎(chǔ)。 研究方法 1.家蠅抗菌肽基因芯片的制備與相關(guān)基因的篩選從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取部分昆蟲

5、抗菌肽基因序列，運用NCBI中相關(guān)服務(wù)器對各基因的全長進行分析，找出其編碼區(qū)，分析出各自的保守序列，以此作為設(shè)計oligo 探針的備選序列，用生物學(xué)軟件Array Designer 2.0對所選序列設(shè)計特異性高、Tm 值接近、長度均一的oligo探針，用直接點樣法將探針點印在特制玻片上制備成寡核苷酸(oligonucleotide)芯片；提取經(jīng)大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)免疫誘導(dǎo)

6、后24小時的家蠅三齡幼蟲脂肪體總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并標記上熒光標記物Cy3，與制備的基因芯片雜交，經(jīng)洗片、掃描處理后進行數(shù)據(jù)分析。 2.一個家蠅新抗菌肽基因cDNA的克隆與生物信息學(xué)分析對篩選出的其中一個有效雜交信號點所對應(yīng)基因的氨基酸保守域設(shè)計簡并引物，行RT-PCR擴增出一個同源片斷；結(jié)合cDNA文庫（本實驗室已構(gòu)建）載體上的下游引物，從所克隆到的同源片斷中設(shè)計出一條特異性上游引物，以cDNA文庫為模板，行PCR擴增

7、出該基因的3′端；再結(jié)合文庫載體上的上游引物，從所克隆到的3′端序列中設(shè)計出一條特異性下游引物，以cDNA文庫為模板，行PCR擴增出該基因的5′端；將兩次所克隆到的cDNA片斷進行拼接，獲得一條家蠅新抗菌肽基因的cDNA序列，并運用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對其進行初步分析。 研究結(jié)果 1.家蠅抗菌肽基因芯片的制備與相關(guān)基因的篩選據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中所獲取的部分昆蟲抗菌肽基因序列，用NCBI中相關(guān)生物學(xué)軟件分析出各自的保守序

8、列，根據(jù)oligo探針的設(shè)計原則，用Array Designer 2.0生物學(xué)軟件共設(shè)計出長度為50bp、Tm為72～77℃、GC含量為40～60％的oligo探針186條，將之點印在特制玻片上制備成oligo芯片；用逆轉(zhuǎn)錄PCR標記技術(shù)對誘導(dǎo)后家蠅三齡幼蟲脂肪體總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并進行Cy3熒光素標記，與制備的芯片雜交，經(jīng)洗片、掃描后進行數(shù)據(jù)分析，在兩次重復(fù)雜交實驗中均能檢測到有效雜交信號的基因點共有15個，在其中一次雜交實驗中

9、檢測到有效雜交信號的基因點共12個，其中所有陽性對照信號清晰，陰性對照和空白對照均為陰性。 2.一個新抗菌肽基因cDNA的克隆與生物信息學(xué)分析對其中一個有效雜交信號的基因點所對應(yīng)基因的氨基酸保守域設(shè)計簡并引物，經(jīng)RT-PCR擴增出一長為131bp的同源片斷；結(jié)合cDNA文庫載體上的上、下游引物，以cDNA文庫為模板，分別行PCR擴增出長為366bp的3′端cDNA序列和457bp的5′端cDNA序列，將所得3′端與5′端cDN

10、A序列進行拼接，得到一長為460bp的家蠅抗菌肽新基因的cDNA序列，生物信息學(xué)分析該基因序列所編碼的蛋白質(zhì)屬于抗菌肽Attacin基因家族，其cDNA序列的3′端是完整的，存在有一個AATAAA的poly（A）加尾信號和一個poly(A)尾巴，但5′顯示還不完整，Blast比較顯示與雙翅目刺舌蠅、新陸原伏蠅抗菌肽Diptericin基因的同源性較高，分別為80％、91％，推導(dǎo)出的所編碼的氨基酸序列Blast比較顯示與舌刺蠅Dipter

11、icin氨基酸序列同源性為77％、與果蠅Diptericin氨基酸序列同源性為59％、與新陸原伏蠅Diptericin氨基酸序列同源性為51％，初步判斷該cDNA序列可能為家蠅一新抗菌肽基因。 結(jié)論 1.首次制備了家蠅抗菌肽相關(guān)基因芯片，并初步篩選到了27個可能與家蠅抗菌肽相關(guān)的基因，為進一步克隆其新抗菌肽基因奠定了良好的工作基礎(chǔ)； 2.對其中一個有效雜交信號的基因點所對應(yīng)的基因進行了克隆，成功克隆到了一長為46