三角帆蚌抗菌肽基因的克隆和表達分析.pdf

1、以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)為研究材料,根據(jù)本實驗室構(gòu)建的三角帆蚌cDNA文庫中已標注的EST序列,利用RACE法克隆得到兩個三角帆蚌抗菌肽基因(theromacin、big defensin)的cDNA全序列,并對這2個基因的cDNA序列及推測得到的氨基酸序列特征進行分析。利用實驗室克隆得到的三角帆蚌β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)標,半定量PCR分別檢測2個基因在三角帆蚌外套膜、血液、肝、腎、胃、腸、鰓

2、、斧足8個組織的表達差異,并通過嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)感染,研究這2個基因在外套膜、血液、肝臟、腸、鰓和斧足6個組織在感染后不同時間點進行實時熒光定量PCR的表達情況究。通過構(gòu)建2個抗菌肽基因的原核表達載體并用IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)兩個基因的重組質(zhì)粒在表達菌株E.coli BL21(DE3)中表達,SDS-PAGE進行初步分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1)三角帆蚌theromacin基因的克隆和

3、分子結(jié)構(gòu)分析
　　該cDNA序列全長為970bp,5‘端非翻譯區(qū)123bp,3‘端非翻譯區(qū)526bp,開放閱讀框(ORF)長為300bp,共編碼99個氨基酸,包含一段由27個氨基酸組成的信號肽和72個氨基酸的成熟肽,分子量為10924.7u。氨基酸序列分析表明,該序列存在明顯的跨膜結(jié)構(gòu)和疏水區(qū)。同源性分析表明,該基因編碼的蛋白與海兔(Aplysia californica)theromacin氨基酸序列的相似度最高為56％,而與貽

4、貝等中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽(defensins、mytilins、myticins和mytimycins)相似度較低。將所得的氨基酸序列與其他物種的不同抗菌肽的氨基酸序列進行多重序列比對,構(gòu)建系統(tǒng)樹,結(jié)果顯示,本實驗克隆所得三角帆蚌 theromacin與已發(fā)表的幾種無脊椎動物抗菌肽相聚,而不與兩種貽貝的抗菌肽聚集在一起,推測此基因與這兩種貽貝中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽不屬于同一種類型。
　　Jpred3軟件對三角帆蚌theromacin蛋白的二級結(jié)

5、構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明,在第2-22、57-62氨基酸殘基處存在α螺旋,因此,三角帆蚌的theromacin蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。以水螅(Hydra magnipapillata)Hydramacin-1 A鏈三級結(jié)構(gòu)為模板,通過ESyPred3D預(yù)測三角帆蚌theromacin蛋白的三級結(jié)構(gòu)顯示,此蛋白與水螅的Hydramacin-1三級結(jié)構(gòu)相似。
　　2)三角帆蚌big defensin基因的克隆和分子結(jié)構(gòu)分析
　　該cD

6、NA序列全長為604bp,末端有典型的多聚腺苷酸信號序列AATAA和ploy(A)尾,5‘端非翻譯區(qū)166bp,3‘端非翻譯區(qū)96bp,開放閱讀框(ORF)長為342bp,共編碼113個氨基酸,包含一段由23個氨基酸組成的信號肽和90個氨基酸的成熟肽,分子量為12554.6u。氨基酸序列分析表明,該序列存在明顯的跨膜結(jié)構(gòu)和疏水區(qū)。同源性分析顯示,該基因編碼的蛋白與文昌魚(Branchiostoma floridae)big defens

7、in氨基酸序列的相似度最高為64%,而與已知的防御素(α-、β-、θ-防御素和昆蟲防御素)相似度較低。與已知big defensin氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn),在成熟肽部分均有相同的保守序C-X6-C-X3-C-X13(14)-C-X4-C-C。構(gòu)建系統(tǒng)樹結(jié)果顯示,本實驗所得的big defensin與已知的big defensins聚在一起。
　　Jpred3軟件對該基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明,在第7-35、43-66氨基酸殘基

8、處存在α螺旋,在第41-42、95-97以及第104-108氨基酸殘基處存在β折疊。由此,該基因編碼的蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。以Takahide Kouno報道的日本馬蹄蟹(Japanese horseshoe crab)beta-defensin三級結(jié)構(gòu)(PDB id:2RNG)為模板,通過ESyPred3D預(yù)測獲得了HcBD蛋白的三級結(jié)構(gòu),二者結(jié)構(gòu)相似。
　　3)半定量和熒光定量分析
　　利用RT-PCR法以β-ac

9、tin基因作為內(nèi)參基因,檢測theromacin和big defensin兩個基因在健康三角帆蚌外套膜、血液、肝臟、胃、腸、鰓和斧足中的表達情況:
　　theromacin基因在8個組織中均有表達,其中在三角帆蚌血液中的表達量最高,在外套膜、肝臟和鰓中微量表達,在腎、胃、腸和斧足中表達量較少。
　　big defensin基因在8個組織中并非完全表達,僅在外套膜、血液、肝、腎、胃和腸中有表達,其中,在健康三角帆蚌外套膜、血液

10、中的表達量相對其他組織較高,在肝、腎、胃和腸中的表達量較低,在鰓和斧足中沒有檢測到有big defensin基因的表達。
　　在受嗜水氣單胞菌感染后2h、4h、6h、12h、24h、48h和72h等7個時間點檢測theromacin、big defensin在外套膜、血液、肝臟、腸、鰓和斧足中的表達情況。
　　在外套膜中,theromacin、big defensin分別在4h、6h表達量最高,而二者均在12h表達量最低;在

11、血液中,theromacin、big defensin均在72h表達量最高,分別在6h、48h表達量最低;在肝臟中,theromacin在4h表達量最高,而big defensin在48h達到峰值,二者均在24h表達量最低;在腸中,theromacin、big defensin的峰值和最低值分別是4h和24h、72h和6h;在鰓中,二者的峰值和最低值分別是4h和24h,2h和6h;在斧足中,二者均在4h達到峰值,分別在24h、12h表達