三角帆蚌二個與珍珠質(zhì)量相關基因克隆及表達分析.pdf

1、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是中國特有的淡水育珠蚌,所產(chǎn)珍珠質(zhì)量較高。研究貝殼形成相關的基因,對提高三角帆蚌的產(chǎn)珠性能有重要意義。本論文根據(jù)已構建的三角帆蚌cDNA文庫中標注的EST序列,利用cDNA末端快速擴增法(RACE)克隆了三角帆蚌的37kDaLRP基因和一個金屬結合蛋白基因的cDNA全序列,對這2個基因的cDNA和氨基酸序列進行了分析;利用實時熒光定量PCR技術研究了這2個基因在三角帆蚌中的表達情況;并利用

2、原位雜交技術進一步研究了37kDaLRP基因在外套膜中的分布;利用原核表達技術對這個金屬結合蛋白進行了蛋白表達。主要研究結果如下:
　　1.三角帆蚌2個基因cDNA全序列的克隆及分子特征
　　三角帆蚌37 kDa LRP基因的全長cDNA序列(登錄號為JX441866),全長1133bp,5′端UTR為71 bp,3′UTR為159 bp,開放閱讀框長度為903bp,可編碼300個氨基酸殘基。預測原子總量為4625,分子量大

3、約為33.1 kDa。三角帆蚌37kDa LRP的氨基酸序列與其他物種的LRP相似度較高,與合浦珠母貝(Pinctadafucata)相似度最高,為80％,與牛(Bostaurus)、綠猴(Chlorocebusaethiops)及大鼠(Rattus norvegicus)的相似度為73%,與人(Homosapiens)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的相似度為72%。
　　三角帆蚌一個金屬結合蛋白基因的cDNA全序列(登

4、錄號為JQ358609),長508 bp,5′端UTR為35 bp,3′UTR為119 bp,開放閱讀框長度為354bp?？删幋a117個氨基酸殘基,預測原子總量為1767,分子式為C557H887N145O161S17,分子量大約為12.7 kDa,理論等電點為7.4。不穩(wěn)定指數(shù)為36.81,表明此蛋白性質(zhì)較穩(wěn)定。半胱氨酸和甘氨酸的含量最高,為10.3%;組氨酸含量最少,為0.9%。帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)12個,帶正電荷氨

5、基酸殘基(Arg+Lys)13個。結構域分析表明,N端含有19個氨基酸的信號肽序列。有1個跨膜結構,位于第3-22位。
　　2.三角帆蚌2個基因的熒光定量分析
　　37kDaLRP基因在外套膜、血液、鰓、斧足、肝、腎、腸和閉殼肌組織中均有表達,在肝臟組織中有較高水平的表達,血液中表達量最低,其余組織中表達水平基本相當。破殼誘導實驗中,該基因在肝臟組織中總體呈現(xiàn)出先升高再降低再升高的表達趨勢,破殼第1天至第2天,實驗組的表達量

6、明顯高于對照組,自破殼后第4天開始,實驗組開始低于對照組。外套膜組織中的該基因在整個貝殼修復過程中,總體呈現(xiàn)出先升高后降低的表達趨勢。每一時間點的實驗組表達水平均高于對照組,在24小時時表達量達到最高。貝殼修復完成之后,又恢復到正常表達水平。
　　三角帆蚌該金屬結合蛋白基因在各組中的表達結果顯示,在鰓中的表達量最高,外套膜次之,血液中表達最低。這個金屬結合蛋白基因在白色蚌外套膜中的表達量均高于紫色蚌,在白色蚌與紫色蚌外套的中后部表

7、達量高于前部。
　　3.三角帆蚌37kDaLRP原位雜交實驗分析
　　37kDaLRPmRNA在三角帆蚌外套膜組織中的原位雜交實驗結果表明,較強的雜交陽性信號出現(xiàn)在外套膜中褶的外上皮細胞、外褶的內(nèi)外上皮細胞以及腹膜的上皮細胞層,推測三角帆蚌中37kDaLRP基因參與了角質(zhì)層、棱柱層及珍珠層的形成過程。
　　4.三角帆蚌一個金屬結合蛋白原核表達實驗
　　在30℃條件下,用0.2mM的IPTG誘導該金屬結合蛋白基因的