三角帆蚌二個(gè)與珍珠質(zhì)量相關(guān)基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是中國(guó)特有的淡水育珠蚌,所產(chǎn)珍珠質(zhì)量較高。研究貝殼形成相關(guān)的基因,對(duì)提高三角帆蚌的產(chǎn)珠性能有重要意義。本論文根據(jù)已構(gòu)建的三角帆蚌cDNA文庫(kù)中標(biāo)注的EST序列,利用cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)克隆了三角帆蚌的37kDaLRP基因和一個(gè)金屬結(jié)合蛋白基因的cDNA全序列,對(duì)這2個(gè)基因的cDNA和氨基酸序列進(jìn)行了分析;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了這2個(gè)基因在三角帆蚌中的表達(dá)情況;并利用

2、原位雜交技術(shù)進(jìn)一步研究了37kDaLRP基因在外套膜中的分布;利用原核表達(dá)技術(shù)對(duì)這個(gè)金屬結(jié)合蛋白進(jìn)行了蛋白表達(dá)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.三角帆蚌2個(gè)基因cDNA全序列的克隆及分子特征
　　三角帆蚌37 kDa LRP基因的全長(zhǎng)cDNA序列(登錄號(hào)為JX441866),全長(zhǎng)1133bp,5′端UTR為71 bp,3′UTR為159 bp,開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為903bp,可編碼300個(gè)氨基酸殘基。預(yù)測(cè)原子總量為4625,分子量大

3、約為33.1 kDa。三角帆蚌37kDa LRP的氨基酸序列與其他物種的LRP相似度較高,與合浦珠母貝(Pinctadafucata)相似度最高,為80％,與牛(Bostaurus)、綠猴(Chlorocebusaethiops)及大鼠(Rattus norvegicus)的相似度為73%,與人(Homosapiens)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的相似度為72%。
　　三角帆蚌一個(gè)金屬結(jié)合蛋白基因的cDNA全序列(登

4、錄號(hào)為JQ358609),長(zhǎng)508 bp,5′端UTR為35 bp,3′UTR為119 bp,開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為354bp?？删幋a117個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)原子總量為1767,分子式為C557H887N145O161S17,分子量大約為12.7 kDa,理論等電點(diǎn)為7.4。不穩(wěn)定指數(shù)為36.81,表明此蛋白性質(zhì)較穩(wěn)定。半胱氨酸和甘氨酸的含量最高,為10.3%;組氨酸含量最少,為0.9%。帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)12個(gè),帶正電荷氨

5、基酸殘基(Arg+Lys)13個(gè)。結(jié)構(gòu)域分析表明,N端含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列。有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),位于第3-22位。
　　2.三角帆蚌2個(gè)基因的熒光定量分析
　　37kDaLRP基因在外套膜、血液、鰓、斧足、肝、腎、腸和閉殼肌組織中均有表達(dá),在肝臟組織中有較高水平的表達(dá),血液中表達(dá)量最低,其余組織中表達(dá)水平基本相當(dāng)。破殼誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,該基因在肝臟組織中總體呈現(xiàn)出先升高再降低再升高的表達(dá)趨勢(shì),破殼第1天至第2天,實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量

6、明顯高于對(duì)照組,自破殼后第4天開(kāi)始,實(shí)驗(yàn)組開(kāi)始低于對(duì)照組。外套膜組織中的該基因在整個(gè)貝殼修復(fù)過(guò)程中,總體呈現(xiàn)出先升高后降低的表達(dá)趨勢(shì)。每一時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平均高于對(duì)照組,在24小時(shí)時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。貝殼修復(fù)完成之后,又恢復(fù)到正常表達(dá)水平。
　　三角帆蚌該金屬結(jié)合蛋白基因在各組中的表達(dá)結(jié)果顯示,在鰓中的表達(dá)量最高,外套膜次之,血液中表達(dá)最低。這個(gè)金屬結(jié)合蛋白基因在白色蚌外套膜中的表達(dá)量均高于紫色蚌,在白色蚌與紫色蚌外套的中后部表

7、達(dá)量高于前部。
　　3.三角帆蚌37kDaLRP原位雜交實(shí)驗(yàn)分析
　　37kDaLRPmRNA在三角帆蚌外套膜組織中的原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,較強(qiáng)的雜交陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)在外套膜中褶的外上皮細(xì)胞、外褶的內(nèi)外上皮細(xì)胞以及腹膜的上皮細(xì)胞層,推測(cè)三角帆蚌中37kDaLRP基因參與了角質(zhì)層、棱柱層及珍珠層的形成過(guò)程。
　　4.三角帆蚌一個(gè)金屬結(jié)合蛋白原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)
　　在30℃條件下,用0.2mM的IPTG誘導(dǎo)該金屬結(jié)合蛋白基因的