三角帆蚌巨噬細(xì)胞移動抑制因子和Smad5基因克隆及表達(dá).pdf

1、本文采用巢氏PCR方法和RACE PCR技術(shù)分別克隆出了三角帆蚌的巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）的cDNA序列和Smad5基因的cDNA序列，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測2個基因在蚌血液、肝胰臟、閉殼肌、外套膜和鰓等幾種不同組織中的表達(dá)情況，通過肽聚糖、脂多糖、嗜水氣單胞菌和葡聚糖對三角帆蚌的刺激，檢測2個基因在血液和肝胰臟中的表達(dá)量的變化。
　　克隆得到的MIF基因的cDNA全長序列為723 bp，其中5’UTR有69 bp；

2、3’UTR有309 bp；開放閱讀框的堿基長度為345 bp，342個堿基編碼114個氨基酸。經(jīng)Expasy在線網(wǎng)站的SignalP4.1分析氨基酸，該蛋白理論分子量為13.83 kD，等電點(diǎn)為5.91，不含信號肽。此氨基酸序列沒有Trp殘基，其結(jié)構(gòu)平均疏水性為-0.165，一共有4個絲磷酸化位點(diǎn)，分別為Ser13, Ser59, Thr10, Thy37，沒有硫化位點(diǎn)。三角帆蚌MIF蛋白的預(yù)測三級結(jié)構(gòu)其均由6個α螺旋和12個β折疊片組

3、成，MIF含有三個結(jié)構(gòu)域，是一個三聚體蛋白質(zhì)。
　　利用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測了 MIF基因在三角帆蚌不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明 MIF的mRNA在蚌的血液、外套膜、肌肉、鰓和肝胰腺各組織中均有表達(dá)。其中，肌肉組織的表達(dá)量最高，肝胰腺次之，外套膜和鰓的表達(dá)量相當(dāng)，血液中最少。分別用嗜水氣單胞菌和脂多糖刺激后，MIF的mRNA在血液和肝胰臟中均有一定量的表達(dá)，在肝胰臟中的變化最為明顯，分別是空白組的2.1倍和1.19倍。結(jié)果表明三

4、角帆蚌在受到病害后，MIF起著免疫防御的作用。
　　將三角帆蚌MIF序列與表達(dá)載體PET-30a連接，成功構(gòu)建了PET-30a-MIF原核表達(dá)質(zhì)粒，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)并純化出蛋白。經(jīng)分析確認(rèn)重組蛋白20 KD左右，與預(yù)測的蛋白大小相符。
　　Smad5基因序列長度1627 bp，其中5’UTR（非編碼區(qū)）7 bp，開放閱讀框（ORF）長度為1386 bp，3’UTR長度為234 bp，編碼461個氨基酸，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)