三角帆蚌珍珠形成相關(guān)基因的克隆與表達分析.pdf

1、三角帆蚌（Hypriosis cumingii）是我國主要的淡水育珠蚌，其每年的淡水珍珠產(chǎn)量占世界的95％以上。研究三角帆蚌珍珠形成相關(guān)基因的功能對珍珠形成機制研究具有重要意義。通過三角帆蚌轉(zhuǎn)錄組測序得到的信息，篩選出2個perlucin基因和BMP7基因部分基因序列，采用RACE技術(shù)得到3個基因cDNA全長序列。為研究這3個基因的功能，首先對7個管家基因進行穩(wěn)定性分析，最終得到3個合適的內(nèi)參基因。利用熒光定量技術(shù)對3個基因在不同組織中

2、、貝殼修復過程中及早期珍珠形成過程中表達量進行分析，利用原位雜交技術(shù)對基因在外套膜的表達進行定位分析。嘗試將 Hc-perlucin1蛋白在原核系統(tǒng)中進行表達。主要的研究結(jié)果如下：
　?。?）三角帆蚌內(nèi)參基因的篩選
　　對β-actin、β-tubulin、elongation factor1 alpha（EF1α）、GAPDH、ubiquitin、ribosomal protein L18（Rpl18）以及cyclophi

3、lin共7個管家基因，采用BestKeeper，geNorm和NormFinder軟件分析了其在不同組織間、不同季節(jié)外套膜、貝殼修復過程和早期珍珠形成過程中的表達穩(wěn)定性。結(jié)果表明，Ubi、RPL18和EF1α這3個管家基因在本論文所設(shè)置的實驗條件下的表達相對穩(wěn)定，是作為研究三角帆蚌貝殼和珍珠形成中基因表達分析的合適內(nèi)參基因。
　?。?）2個perlucin基因的克隆及表達分析
　　克隆得到2個C型凝聚素基因Hc-perluc

4、in1和Hc-perlucin2，兩基因cDNA全長分別是1460 bp和1973 bp，包括18 bp和438 bp的5’端非翻譯區(qū)（UTR），908 bp和972 bp的3’端非翻譯區(qū)（UTR）。分別可編碼161個和183個氨基酸，Hc-perlucin1基因有信號肽，而Hc-perlucin2基因無信號肽。兩個基因都含有6個保守的半胱氨酸和1個CRD結(jié)構(gòu)域。Hc-perlucin1和Hc-perlucin2基因在C端分別是―QPS

5、‖和―EPN‖，這說明它們分別與半乳糖和甘露糖特異性結(jié)合。通過熒光定量分析，兩個基因在三角帆蚌9個組織中均有表達，在鰓、閉殼肌和外套膜表達量都比較高。除此之外，Hc-perlucin1在血細胞中的表達量也比較高，Hc-perlucin2基因在腸道中表達量較高。在貝殼修復過程中 Hc-perlucin1基因在珍珠層形成過程中表達量有明顯的上升，而 Hc-perlucin2基因表達量則有所下降。在早期珍珠形成過程中，兩個基因表達量都有明顯的

6、上升。原位雜交結(jié)果也顯示兩個基因在外套膜中的表達位置一致，都在外套膜外側(cè)上皮細胞中表達，該區(qū)域的細胞主要是參與珍珠層的形成。因此，三角帆蚌perlucin基因可能參與了珍珠層的形成。
　?。?）Hc-BMP7基因的克隆與表達分析
　　克隆得到Hc-BMP7基因cDNA全長為2080 bp，包括377 bp的5’端非翻譯區(qū)（UTR）和401 bp的3’端非翻譯區(qū)（UTR）。開放閱讀框的長度是1287 bp，可編碼428個氨基酸

7、，前26個氨基酸是信號肽。Hc-BMP7含有一個TGF-β家族指紋，TGF-beta propeptide和TGFB兩個結(jié)構(gòu)域。Hc-BMP7在9個組織中均有表達，其中以性腺、鰓、腎臟和外套膜的表達量較高。在貝殼修復過程和早期珍珠形成過程中，該基因在外套膜和珍珠囊中的表達量均沒有上調(diào)。原位雜交結(jié)果顯示該基因在外套膜外側(cè)上皮細胞和外套膜緣膜外褶上表達。
　?。?）Hc-perlucin1蛋白的原核表達
　　通過 PCR擴增得到

8、 Hc-perlucin1基因整個開放閱讀框，與線性表達載體pET-28a連接組成重組載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導表達重組融合蛋白 pET-28a-Hc-perlucin1。通過不同梯度的培養(yǎng)溫度、IPTG濃度以及誘導時間的實驗組合，實驗結(jié)果表示重組融合蛋白在最佳表達條件分別為：37℃、0.1 mmol/L IPTG、6 h。pET-28a-Hc-perlucin1重組融合蛋白主要以包涵體形式存在。通過SDS-