三角帆蚌肽聚糖識別蛋白和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的基因克隆和功能分析.pdf

1、三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國南方的一種重要淡水珍珠蚌類之一,同時也是一類水生環(huán)境監(jiān)測和湖泊生態(tài)修復(fù)生物,由于其對環(huán)境污染物的高度積累和耐受性,給水生生態(tài)系統(tǒng)和人類健康帶來了潛在的風(fēng)險,因此對其免疫防御和免疫毒性相關(guān)分子的研究具有重要意義。本文構(gòu)建了三角帆蚌肝胰腺差減cDNA文庫,克隆了三角帆蚌肽聚糖識別蛋白(PGRPs)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)兩種基因,并對其基因特性、表達(dá)模式和功能特征進(jìn)行了研究。

2、　　通過抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建了三角帆蚌肝胰腺差減cDNA文庫,對篩選的將近400個克隆進(jìn)行序列測定,通過生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)其中98個差異表達(dá)明顯。這些基因包括細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架重構(gòu)相關(guān)蛋白、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)相關(guān)基因、免疫防御相關(guān)蛋白、細(xì)胞物質(zhì)和能量代謝相關(guān)蛋白、翻譯和轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子等。研究結(jié)果大大豐富了蚌類基因組數(shù)據(jù),同時首次獲得了蚌類應(yīng)對MC-LR毒性效應(yīng)的基本數(shù)據(jù)。
　　三角帆蚌肽聚糖識別蛋白(HcPGRPS1)的cDNA序

3、列全長1137bp,包含708bp的開放閱讀框,編碼235個氨基酸。氨基酸序列同源性比對發(fā)現(xiàn)HcPGRPS1在C端有一個保守的PGRP結(jié)構(gòu)域以及酰胺酶活性所需的一些保守位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明HcPGRPS1與太平洋牡蠣CgPGRPS3的親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR顯示,HcPGRPS1在三角帆蚌的組織中呈組成型表達(dá),在肝胰腺中表達(dá)量最高,其次為性腺和腸。LPS刺激后HcPGRPS1在腎臟、性腺、鰓和肌肉中表達(dá)顯著性上調(diào),PGN刺激后H

4、cPGRPS1在腎臟和性腺中的表達(dá)顯著性上調(diào)。在Zn2+存在的情況下pET21a-HcPGRPS1重組蛋白對金黃色葡萄球菌來源的Lys-肽聚糖和枯草芽孢桿菌來源的DAP-肽聚糖均具有結(jié)合活性和酰胺酶活性,并且對革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌以及革蘭氏陰性菌的大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌這四種細(xì)菌都具有抑菌活性。這些結(jié)果表明HcPGRPS1在貝類抵抗和防御病原微生物入侵的先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要功能。
　　三角帆蚌肽聚糖識別蛋

5、白(HcPGRPS2)的cDNA序列全長973bp,包含657bp的開放閱讀框,編碼218個氨基酸。此外,還克隆獲得HcPGRPS2的1個剪接異構(gòu)體,全長537bp,編碼151個氨基酸。氨基酸序列同源性比對發(fā)現(xiàn)HcPGRPS2在C端有一個保守的PGRP結(jié)構(gòu)域以及酰胺酶活性所需的一些保守位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明HcPGRPS2與夏威夷短尾魷魚EsPGRP4的親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR和免疫印跡分析顯示,HcPGRPS2在三角帆蚌的組織中

6、呈組成型表達(dá),在肝胰腺中表達(dá)量最高,其次為腸。LPS刺激后HcPGRPS2在肌肉和肝胰腺中表達(dá)顯著性上調(diào),PGN刺激后HcPGRPS2在肝胰腺、鰓和性腺中表達(dá)顯著性上調(diào)。
　　三角帆蚌谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(HcGSTS)的cDNA序列全長996bp,包含612bp的開放閱讀框,編碼203個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量為23.3kDa,理論等電點(diǎn)為5.46,其與菲律賓蛤仔RpGSTS1的相似性最高,為58％。序列分析顯示HcGSTS不僅在N-

7、末端含有高度保守的GSH結(jié)合位點(diǎn),而且在C-末端含有相對多樣化底物結(jié)合位點(diǎn)。多重序列比對分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明HcGSTS屬于GST基因家族中的sigma家族。熒光定量PCR顯示,HcGSTS在三角帆蚌的組織中呈組成型表達(dá),在肝胰腺中最高,其次為腎臟和性腺。LPS刺激后HcGSTS在肝胰腺、腎臟、性腺、鰓和肌肉中均出現(xiàn)顯著性上調(diào)表達(dá),PGN刺激后HcGSTS在肝胰腺、性腺、腎臟和肌肉中均出現(xiàn)顯著性上調(diào)表達(dá),而在MC-LR刺激后HcGS