三角帆蚌貝殼珍珠層顏色形成相關(guān)基因的克隆與表達分析.pdf

1、三角帆蚌是我國特有的優(yōu)良淡水育珠蚌。顏色是評價珍珠質(zhì)量的重要指標(biāo)。供片貝貝殼珍珠層顏色(貝殼內(nèi)殼色)顯著影響珍珠顏色。本研究從珍珠或貝殼珍珠層呈色的直接因素（金屬離子、有機物和珍珠層結(jié)構(gòu)）著手，以實驗室構(gòu)建的紫色家系三角帆蚌（貝殼珍珠層顏色為紫色）和白色家系三角帆蚌（貝殼珍珠層顏色為白色）為實驗材料，從紫色家系和白色家系三角帆蚌外套膜和珍珠囊比較轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選得到4個三角帆蚌貝殼珍珠層顏色形成相關(guān)基因。
　　1．三角帆蚌HcGI

2、FLP基因的克隆與表達分析
　　克隆得到三角帆蚌兩個胃內(nèi)因子樣蛋白（gastric intrinsic factor-like protein，GIFLP）基因（HcGIFLP1和HcGIFLP2），并進行熒光定量、原位雜交及原核表達實驗。HcGIFLP1基因cDNA全長619bp，編碼140個氨基酸；HcGIFLP2基因cDNA全長821bp，編碼148個氨基酸，GenBank登錄號分別為KR822703和KR822704。Hc

3、GIFLP1和HcGIFLP2基因編碼的多肽N端均含有一段由23個氨基酸組成的信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列和氨基酸序列相似度均較高。熒光定量結(jié)果顯示，HcGIFLP1基因主要在肝胰腺中表達，并且在紫色蚌中的表達量極顯著高于白色蚌（P<0.01）。HcGIFLP2基因主要在外套膜中表達，在紫色蚌后端緣膜中的表達量極顯著高于白色蚌（P<0.01）。原位雜交結(jié)果顯示，HcGIFLP1和HcGIFLP2基因在外套膜中的表達部位基本相同，雜交

4、信號主要出現(xiàn)在外套膜緣膜的外上皮細胞，邊緣膜中褶的外上皮細胞中也有一些信號。原核表達結(jié)果顯示，兩個基因的重組蛋白均主要以包涵體的形式存在。根據(jù)兩個基因的氨基酸序列設(shè)計多肽制備多克隆抗體，并用原核表達純化蛋白檢測抗體的特異性，結(jié)果顯示HcGIFLP1蛋白的抗體特異性較好，只能檢測到自身的重組蛋白，HcGIFLP2蛋白的抗體未能檢測到自身及HcGIFLP1的重組蛋白。
　　2．三角帆蚌HcCUBDC基因的克隆與表達分析
　　克隆

5、得到三角帆蚌一個CUB結(jié)構(gòu)域包含蛋白（CUB domain containing protein，CUBDC）基因HcCUBDC，并進行熒光定量和原位雜交檢測分析。HcCUBDC基因cDNA全長5158 bp，編碼639個氨基酸，GenBank登錄號為KP067952。HcCUBDC蛋白含有4個CUB結(jié)構(gòu)域，屬于CUB超家族，N端含有一段由19個氨基酸組成的信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)域。熒光定量結(jié)果顯示，HcCUBDC基因在各個組織中均有表達，

6、其中肝胰腺中表達量最低。在紫色蚌中，后端緣膜表達量極顯著高于前端緣膜（P<0.01）；在白色蚌中，前端和后端緣膜之間表達差異不顯著。HcCUBDC基因在紫色蚌后端緣膜中表達量極顯著高于白色蚌（P<0.01），在紫色和白色蚌前端緣膜中表達差異不顯著。外套膜原位雜交結(jié)果顯示，HcCUBDC基因主要在外套膜緣膜外上皮細胞中表達。
　　3．三角帆蚌HcCA2基因的克隆與表達分析
　　克隆得到了三角帆蚌一個碳酸酐酶（carbonic

7、anhydrase，CA）基因HcCA2基因，并進行熒光定量和原位雜交檢測分析。HcCA2基因cDNA全長1770bp，編碼332個氨基酸，GenBank登錄號為KR822705。HcCA2蛋白含有1個CA結(jié)構(gòu)域，屬于α-CA超家族，N端含有一段由18個氨基酸組成的信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR結(jié)果顯示，HcCA2基因主要在外套膜中表達，在其他組織中表達量很低。在紫色蚌中，后端緣膜表達量極顯著高于前端緣膜（P<0.01）；在白色蚌

8、中，前端和后端緣膜之間表達差異不顯著。HcCA2基因在紫色蚌后端緣膜中的表達量極顯著高于白色蚌（P<0.01），在紫色和白色蚌前端緣膜中的表達差異不顯著。在珍珠形成過程中，插片后的前19天該基因表達量很低，19天之后表達量顯著升高并維持在同一水平。貝殼修復(fù)過程中，該基因在對照組中表達不穩(wěn)定，在前7個時間點處理組中的表達量均極顯著低于對照組（P<0.01），在后7個時間點處理組幾乎不表達。原位雜交結(jié)果顯示，HcCA2基因在外套膜內(nèi)外上表皮