3135.三角帆蚌免疫相關(guān)基因hsp70、tnfaip8、gbp1及tlr2的克隆與表達分析

1、分類號：密級：學(xué)校代碼：10414學(xué)號：2013010794碩士研究生學(xué)位論文三角帆蚌免疫相關(guān)基因三角帆蚌免疫相關(guān)基因HSP70、TNFAIP8、GBP1及TLR2的克隆與表達分析的克隆與表達分析CloningexpressionanalysisofimmunerelatedgenesHSP70、TNFAIP8、GBP1TLR2fromHyriopsiscumingii吳圣楠吳圣楠院所：生命科學(xué)學(xué)院導(dǎo)師姓名：劉毅副教授學(xué)科專業(yè)：生物化學(xué)

2、與分子生物學(xué)研究方向：分子免疫學(xué)二○一六年五月I摘要三角帆蚌（Hyriopsiscumingii）是我國特有的淡水良種育珠貝，易受病害威脅而遭受重大經(jīng)濟損失，開展三角帆蚌免疫相關(guān)基因研究具有十分重要的現(xiàn)實意義。本研究采用RACE技術(shù)，對高通量轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的三角帆蚌（Hyriopsiscumingii）熱休克蛋白70（HSP70）、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8（TNFAIP8）、干擾素誘導(dǎo)的鳥苷酸結(jié)合蛋白1（GBP1）與Toll樣受體2（

3、TLR2）基因的長片段進行擴增，拼接得到這四種免疫相關(guān)基因的cDNA序列全長，采用熒光定量PCR（qRTPCR）技術(shù)研究了HcHSP70和HcTNFAIP8基因在各組織中的表達分布情況及其應(yīng)激表達情況，并采用Westernblot技術(shù)從蛋白質(zhì)水平研究溫度刺激對HcHSP70表達的影響。HcHSP70基因cDNA序列全長2298bp，開放閱讀框為1974bp，編碼657個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量大小為71.6kDa。含有三個HSP70家族典

4、型的標(biāo)簽序列，末端保守區(qū)域EEVD以及典型的重復(fù)位點GGXP。與其他物種HSP70同源性很高，最高達91%，通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)HcHSP70與其它4種軟體動物HSP70聚為一支。HcHSP70在肝胰腺中表達量最高，其次是性腺，而在鰓、外套膜及肌肉中的表達量較低。實時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)顯示，鰓組織中HcHSP70mRNA和蛋白的表達量隨水溫上升而上調(diào)，37℃時表達量顯著上升到最高值，而40℃時表達量恢復(fù)至正常水

5、平。HcTNFAIP8基因cDNA序列全長1179bp，開放閱讀框為573bp，編碼190個氨基酸，預(yù)測分子量大小為23.64kDa。HcTNFAIP8與長牡蠣CgTNFAIP8相似性最高為71%，且在系統(tǒng)進化樹的同一個分支上。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：HcTNFAIP8在性腺中表達量最高，其次為肝胰腺，而在鰓、外套膜及心臟中表達量較低；HcTNFAIP8的表達并不受PGN的誘導(dǎo)影響，而在LPS刺激后，HcTNFAIP8表達量出現(xiàn)先顯

6、著下調(diào)再上調(diào)情況，最終恢復(fù)接近到正常值。HcGBP1基因cDNA全長為2418bp，開放閱讀框為1947bp，編碼648個氨基酸，預(yù)測分子量大小為76.28kDa。同源序列比對發(fā)現(xiàn)HcGBP1與非洲爪蟾GBP1處于同一個大分支中；HcTLR2基因cDNA序列全長1177bp開放閱讀框為1032bp，編碼343個氨基酸，預(yù)測分子量大小為39.58kDa，同源序列比對發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)三角帆蚌與馬氏珠母貝聚為一支。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：三角帆蚌；熱休克蛋白