團頭魴兩種肝臟表達抗菌肽和β防御素基因的克隆與表達研究.pdf

1、肝臟表達抗菌肽1（liver-expressed antinicrobial peptide1，LEAP-1）、肝臟表達抗菌肽2(LEAP-2)和β防御素(β-defensin)是一類富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，廣泛存在于魚類中，是魚類先天免疫系統(tǒng)的重要成分，在抵御病原微生物入侵的過程中發(fā)揮著重要作用。LEAP-1在體內外具有抑制細菌、真菌、病毒和原生動物生長的作用，在機體鐵平衡的調控方面也發(fā)揮著重要作用。LEAP-2作為另外一種重要的

2、抗菌肽，具有抗菌作用。β-defensin除了能直接殺死細菌和病毒外，還可以間接促進效應細胞的補充，誘導多種細胞因子和趨化因子的表達，促進傷口愈合和血管生成。
　　 團頭魴是我國重要的淡水經濟養(yǎng)殖魚類。為了闡明LEAP-1、LEAP-2和β-defensin在團頭魴早期發(fā)育階段以及細菌免疫應答中的作用，為后續(xù)研究3種抗菌肽在其先天免疫系統(tǒng)中的生物活性奠定理論基礎，本研究通過分子克隆技術獲得團頭魴LEAP-1、LEAP-2基因全長

3、cDNA序列以及β-defensin基因部分cDNA序列，構建3種基因的時空表達譜，并對免疫注射細菌后3種抗菌肽基因在團頭魴組織中的表達變化進行了研究。主要研究結果如下:
　　 1.團頭魴LEAP-1和LEAP-2基因分子克隆與表達分析
　　 團頭魴LEAP-1基因cDNA(GeneBank accession no.JQ308841)全長779 bp，其中開放閱讀框285 bp，5'端非編碼區(qū)115bp，3'端非編碼區(qū)

4、379 bp。開放閱讀框編碼94個氨基酸的前體肽，包括24個氨基酸的信號肽，45個氨基酸的前結構域和25個氨基酸的成熟肽。對團頭魴LEAP-1氨基酸序列進行同源性比較，結果表明團頭魴LEAP-1氨基酸序列與草魚、鳙的相似性最高，達到95％。實時定量PCR分析表明，在胚胎發(fā)育階段，LEAP-1基因mRNA表達量在囊胚中期下降，在眼囊出現(xiàn)期顯著增加到最大值，在尾鰭出現(xiàn)期迅速下降到中等水平。出膜后，LEAP-1基因mRNA表達量在出膜后第1和

5、3d逐漸增加到中等水平，在出膜后第7d降到低水平。在團頭魴成魚組織中，LEAP-1基因mRNA在肝臟中表達量最高。細菌免疫后，團頭魴肝臟中LEAP-1基因mRNA表達量逐漸增加并在注射后144h達到最高(P＞0.05)。腦組織中表達量在注射后72 h達到最大（P＞0.05）。在脾臟和鰓中表達量分別在注射后24h、6h顯著上升(P＜0.05)。
　　 團頭魴LEAP-2基因cDNA(GeneBank accession no.JQ

6、344324)全長564 bp，其中開放閱讀框279 bp，5'端非編碼區(qū)35bp，3'端非編碼區(qū)250 bp。開放閱讀框編碼92個氨基酸的前體肽，包括26個氨基酸的信號肽，25個氨基酸的前結構域和41個氨基酸的成熟肽。對團頭魴LEAP-2氨基酸序列進行同源性比較，結果表明團頭魴LEAP-2氨基酸序列與草魚、斑馬魚的相似性最高，分別達到95％、84％。實時定量PCR分析表明，在胚胎發(fā)育階段，LEAP-2基因mRNA表達水平在原腸胚中期顯

7、著增加到最大值，隨后急劇下降到較低水平并保持到心跳期。在出膜前期表達量顯著增加并在剛出膜階段達到第二個峰值。出膜后，LEAP-2基因mRNA表達量在出膜后第3d顯著下降到較低水平，并上下波動一直持續(xù)到出膜后第31 d。在成魚組織中，LEAP-2基因mRNA在中腸表達量最高。注射細菌后，肝臟中LEAP-2基因mRNA表達水平在注射后72 h和144h顯著上調（P＜0.05）。在脾臟、腦和鰓中，LEAP-2基因mRNA表達量分別在注射后6h

8、、24 h和6h出現(xiàn)顯著上調(P＜0.05)。
　　 2.團頭魴β-defensin1和β-defensin2基因分子克隆與表達分析
　　 團頭魴β-defensin1、β-defensin2基因(maBD-1，maBD-2)部分cDNA序列分別長201 bp和207 bp。maBD-1、maBD-2的登錄號分別為KC351182和KC412160。對團頭魴maBD-1、maBD-2前體肽氨基酸序列進行同源性比較，結果表

9、明maBD-1氨基酸序列與鯉、斑馬魚的相似性最高，分別達到98％、97％。maBD-2氨基酸序列與鯉、斑馬魚相似性最高，分別達到90％、87％。實時定量PCR結果表明，在胚胎發(fā)育階段，maBD-1基因mRNA表達量在心臟出現(xiàn)期之前保持較低水平，在心跳期增加到中等水平。出膜后，maBD-1基因mRNA表達量在出膜后第1d顯著增加到最高值，在出膜第3d后下降到中等表達水平，并進一步降到較低水平。maBD-2基因mRNA表達量在受精卵中最高，