魚類來源的兩種抗菌肽BPI和LEAP2的cDNA克隆及重組表達載體的構(gòu)建.pdf

1、抗生素的濫用導(dǎo)致了大量的耐藥菌株的出現(xiàn),尋找結(jié)構(gòu)特異的新型藥物來對抗這些耐藥菌已經(jīng)成為當務(wù)之急?？咕氖蔷哂袕娍咕饔眯》肿佣嚯?是生物先天免疫的重要組成成分,可保護機體免受革蘭氏陽性菌和陰性菌、真菌、病毒等病原微生物的入侵,有望部分替代抗生素。魚類是水生生物群的重要組成部分,水環(huán)境中有上千種魚類,而每種魚類又可以分泌幾種不同結(jié)構(gòu)的抗菌肽。本文主要研究其中兩種,一種是斑點叉尾鮰和鯉魚來源的抗菌肽殺菌/滲透增強蛋白(bactericida

2、l/permeability increasing protein,BPI),另一種是斑點叉尾鮰來源的肝臟表達的抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide2, LEAP2)。國內(nèi)外有關(guān)這兩種魚類來源抗菌肽的基因工程方面的報道很少。
　　BPI是生物機體細胞中表達的一種能夠特異性殺滅革蘭氏陰性菌的抗菌類蛋白,該蛋白包括氨基端和羧基端兩個結(jié)構(gòu)域,其中氨基端結(jié)構(gòu)域主要承擔殺菌和中和內(nèi)毒素的功能。

3、參考已經(jīng)報道的對人類BPI進行重組DNA表達的研究結(jié)果,首先通過RT-PCR和巢式PCR從斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)鰓中克隆了編碼BPI氨基端活性結(jié)構(gòu)域的cDNA片段“BPINtd”以及含有終止密碼子的片段“BPINtdcf”,此兩個片段均由175個氨基酸殘基組成,其中63個氨基酸殘基在空間上形成一個非極性的脂質(zhì)結(jié)合袋,與革蘭氏陰性菌外膜上脂多糖(LPS)結(jié)合,從而改變細菌膜的通透性,達到殺菌的效果。根據(jù)斑點叉

4、尾鮰與其他生物之間BPI氨基酸序列的比對結(jié)果,發(fā)現(xiàn)氨基端存在40個保守的氨基酸殘基,其中9個高度保守的殘基位于脂多糖結(jié)合區(qū)域內(nèi)。為了進一步建立原核表達系統(tǒng),根據(jù)pET-32a(+)和pET-28a(+)兩種質(zhì)粒的不同特點,選擇其作為原核表達質(zhì)粒,將“BPINtd”片段分別插入兩種質(zhì)粒,通過菌落PCR、EcoR I和Hind III雙酶切反應(yīng)以及DNA測序等方法,證明了重組表達質(zhì)粒“pET-32a-BPINtd”和“pET-28a-BPI

5、Ntd”已被成功構(gòu)建。同時將“BPINtdcf”將該片段插入到pET-28a(+)中,通過菌落PCR、Nde I和Bam HI雙酶切以及DNA測序等,證明重組表達質(zhì)粒“pET-28a-BPINtdcf”被成功構(gòu)建。
　　本文通過RT-PCR和巢式PCR從鯉魚(Cyprinus carpio)鰓中克隆了編碼BPI氨基端的活性結(jié)構(gòu)域“BPINtdcp”,該片段由211個氨基酸殘基組成,也包含由63個氨基酸殘基組成的脂多糖結(jié)合位點。將該

6、片段插入到pET-28a(+)中,通過菌落PCR、Nde I和Hind III雙酶切以及DNA測序,證明了重組表達質(zhì)?！皃ET-28a-BPINtdcp”被成功構(gòu)建。
　　肝臟表達的抗菌肽2(LEAP2)最先是從人血液超過濾產(chǎn)物中得到了含有2對二硫鍵的肝臟表達的抗菌肽。本文以斑點叉尾鮰肝臟為基因克隆的材料,通過RT-PCR對編碼LEAP2成熟肽區(qū)域41個氨基酸的cDNA進行克隆。根據(jù)斑點叉尾鮰與其他魚類及哺乳動物L(fēng)EAP2成熟肽區(qū)

7、域氨基酸序列的比對結(jié)果,發(fā)現(xiàn)存在14個保守的氨基酸殘基,其中4個高度保守的半胱氨酸殘基位于成熟肽的羧基端區(qū)域,在空間上可形成2對二硫鍵,被推測與LEAP2的抗菌活性有關(guān)。進一步構(gòu)建重組表達質(zhì)粒“pET-32a-mLEAP2”,使mLEAP2基因與攜帶有6 x His-tag標簽和腸激酶識別位點的硫氧還蛋白trxA基因融合,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)后,在25℃下,經(jīng)0.7 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)16h后,成功表達了“trx

8、A-mLEAP2”融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE顯示,細胞經(jīng)超聲破碎后,上清和沉淀中均含融合蛋白,采用固化金屬離子親和層析(IMAC)對其進行純化,得到了純化的融合蛋白。
　　本文進一步以“mLEAP2”為模板重新克隆,克隆后得到的新的片段“mLEAP2kex2”含有Xho I和Xba I的酶切位點以及Kex2酶識別位點“AAAAGA”,這個酶切位點的加入可以使α因子信號肽與外源片段的融合蛋白分泌到胞外后,α因子信號肽