鯪魚微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用以及抗菌肽LEAP-2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、第一部分為“鯪魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用”。微衛(wèi)星標(biāo)記是一種以2～6bp的核苷酸序列，成串聯(lián)重復(fù)散布于真核生物基因組中的重復(fù)序列，一般重復(fù)數(shù)為4～60次，具有保守性、共顯性遺傳和多態(tài)性程度高等遺傳特點(diǎn)。目前這一標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的遺傳研究和種質(zhì)鑒定。本研究從鯪魚基因組中開發(fā)出此標(biāo)記，并將其應(yīng)用于鯪魚養(yǎng)殖群體和野生群體的遺傳多樣性研究。首先通過磁珠富集法構(gòu)建鯪魚微衛(wèi)星富集文庫，采用的生物素探針為(CA)15°所建文庫共約200

2、0個(gè)克隆，隨機(jī)選取900個(gè)，通過同位素雜交進(jìn)行二次篩選，得到陽性克隆252個(gè)(陽性克隆率約為28％)，送出測序60個(gè)，得到56個(gè)(93.3％)含有微衛(wèi)星序列的克隆。其中，完美型微衛(wèi)星49個(gè)(87.5％)，非完美型微衛(wèi)星2個(gè)(3.6％)，復(fù)合完美型微衛(wèi)星5個(gè)(8.9％)；95.56％的微衛(wèi)星序列與探針序列CA(GT)重復(fù)單元相符，此外還觀察到CT(AG)的重復(fù)序列；53.6％的微衛(wèi)星DNA其核心序列的重復(fù)長度為10～60bp。在這56個(gè)微

3、衛(wèi)星序列中,45個(gè)含有合適片斷長度的側(cè)翼序列，適合設(shè)計(jì)引物。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.00和Primer 3.0，共設(shè)計(jì)引物39對。通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行篩選，結(jié)果有18對能擴(kuò)增出清晰的條帶，其中12對具有多態(tài)性。用這12對引物對鯪魚野生(30尾)和養(yǎng)殖(20尾)兩個(gè)群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示：在12個(gè)位點(diǎn)共有109個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)9.08個(gè)；野生群體12個(gè)位點(diǎn)期望雜合度變動(dòng)范圍為0.2815～0.935

4、6，養(yǎng)殖群體12個(gè)位點(diǎn)期望雜合度變動(dòng)范圍為0.2615～0.9500;野生群體和養(yǎng)殖群體的平均表觀雜合度分別為0.6361和0.6417；以上數(shù)據(jù)均說明養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性相比野生群體并沒有下降。UPGMA樹、GST值和遺傳距離是檢測群體之間遺傳分化程度的幾個(gè)非常重要的指標(biāo)：鯪魚UPGMA系統(tǒng)樹結(jié)果顯示了兩個(gè)群體之間并沒有明顯的聚類；養(yǎng)殖群體和野生群體之間的遺傳距離為0.1546，遺傳相似性為0.8568；兩者之間的Gst為0.0473

5、。綜合上述三個(gè)指標(biāo)，我們認(rèn)為鯪魚養(yǎng)殖群體和野生群體之間遺傳分化程度不高。雖然如此，依然要密切關(guān)注鯪魚種群在遺傳水平上的變化發(fā)展，使鯪魚的優(yōu)良種群資源得到持續(xù)。本實(shí)驗(yàn)獲得的微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性較高，可用于鯪魚其他群體的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究，并為與鯪魚經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的連鎖定位及其品種優(yōu)化打下基礎(chǔ)。 第二部分為“皮膚特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抗菌肽LEAP-2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建”?？咕?AMPs)是一種小分子肽，是生物體內(nèi)天然免疫系

6、統(tǒng)的重要元素，在機(jī)體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用，更被認(rèn)為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分。隨著分子遺傳學(xué)的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為魚類育種的重要手段之一。于是希望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗菌肽基因轉(zhuǎn)入虹鱒魚，使其抗菌能力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了皮膚特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抗菌肽LEAP-2基因真核表達(dá)載體，為抗菌肽轉(zhuǎn)基因虹鱒魚的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。首先用限制性內(nèi)切酶Age Ⅰ和Not Ⅰ，雙酶切含有斑點(diǎn)叉尾鮰LEAP-2(肝臟表達(dá)抗菌肽)基因的pSP

7、ORT 1重組質(zhì)粒，同樣的酶雙酶切含有斑馬魚Ⅱ型細(xì)胞角蛋白基因(CK)啟動(dòng)子的pCK-EGFP1真核表達(dá)載體，得到的LEAP-2基因片段和含有皮膚特異啟動(dòng)子的表達(dá)載體pCK-E通過T4 DNA連接酶進(jìn)行定向連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，然后從DH5a中分離純化重組表達(dá)質(zhì)粒pCK-LEAP-2。分別用雙酶切和PCR方法鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒：pCK-LEAP-2經(jīng)Age Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切后產(chǎn)生出大小約0.9kb和5.7kb的兩個(gè)片段

8、；經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生出大小約500bp的目的片段。兩項(xiàng)檢測結(jié)果均表明已成功構(gòu)建出皮膚特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抗菌肽LEAP-2基因真核表達(dá)載體。未來，將把所構(gòu)建的抗菌肽基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入虹鱒魚基因組內(nèi)，并構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因虹鱒家系，對虹鱒養(yǎng)殖病害的防治起著舉足輕重的作用。如今，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提倡的健康養(yǎng)殖理念已深入人心，聯(lián)系到前幾年我國出口的水產(chǎn)品因?yàn)樗幬餁埩舫瑯?biāo)多次遭到歐美制裁，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和不良的國際影響，轉(zhuǎn)基因抗病品種的培育就越顯得緊迫和